理学研究科 生命理学専攻 博士課程後期課程
理学研究科 生命理学専攻 博士課程前期課程
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2012年4月 - 現在理学部 生命理学科 教授
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2012年4月 - 現在理学研究科 生命理学専攻 博士課程前期課程 教授
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2012年4月 - 現在理学研究科 生命理学専攻 博士課程後期課程 教授
研究者詳細
2025/01/30 更新
ライフサイエンス / 細胞生物学
国名: 日本国
国名: 日本国
国名: 日本国
Alternative splicing of Mff regulates AMPK-mediated phosphorylation, mitochondrial fission and antiviral response
Yuki Hanada, Risa Maeda, Takaya Ishihara, Masaki Nakahashi, Yuichi Matsushima, Emi Ogasawara, Toshihiko Oka, Naotada Ishihara
Pharmacological Research 107414 - 107414 2024年9月
Tatsuya Shioda, Ittetsu Takahashi, Kensuke Ikenaka, Naonobu Fujita, Tomotake Kanki, Toshihiko Oka, Hideki Mochizuki, Adam Antebi, Tamotsu Yoshimori, Shuhei Nakamura
Proceedings of the National Academy of Sciences120 ( 39 ) 2023年9月18日
TIM23 facilitates PINK1 activation by safeguarding against OMA1-mediated degradation in damaged mitochondria 査読有り
Shiori Akabane, Kiyona Watanabe, Hidetaka Kosako, Shun-ichi Yamashita, Kohei Nishino, Masahiro Kato, Shiori Sekine, Tomotake Kanki, Noriyuki Matsuda, Toshiya Endo, Toshihiko Oka
Cell Reports 112454 - 112454 2023年5月
Rikuhide Koma, Tsubasa Shibaguchi, Claudia Pérez López, Toshihiko Oka, Thomas Jue, Hisashi Takakura, Kazumi Masuda
Physiological Reports9 ( 5 ) e14769 2021年3月
Seiko Nakamura, Aiko Matsui, Shiori Akabane, Yasushi Tamura, Azumi Hatano, Yuriko Miyano, Hiroshi Omote, Mizuho Kajikawa, Katsumi Maenaka, Yoshinori Moriyama, Toshiya Endo, Toshihiko Oka
Communications Biology3 ( 1 ) 2020年12月
In vitro synthesis of the human calcium transporter Letm1 within cell-sized liposomes and investigation of its lipid dependency 査読有り
Okamura, K, S. Matsushita, Y. Kato, H. Watanabe, A. Matsui, T. Oka, T. Matsuura
J. Biosci. Bioeng.127 ( 5 ) 544 - 548 2019年5月
Concentration of mitochondrial DNA mutations by cytoplasmic transfer from platelets to cultured mouse cells. 査読有り
Ishikawa, K, K. Kobayashi, A. Yamada, M. Umehara, T. Oka, K. Nakada
PLOS ONE 2019年
Inactivation of cardiolipin synthase triggers changes in mitochondrial morphology 査読有り
Matsumura, A, Higuchi, J, Watanabe, Y, Kato, M, Aoki, K, Akabane, S, Endo, T, Oka, T
FEBS Letters592 ( 2 ) 209 - 218 2018年1月1日
Structural insights into ubiquitin phosphorylation by PINK1 査読有り 国際誌
Okatsu, K, Y. Sato, K. Yamano, N. Matsuda, L. Negishi, A. Takahashi, A. Yamagata, S. Goto-Ito, M. Mishima, Y. Ito, T. Oka, K. Tanaka, S. Fukai
Sci. Rep.8 ( 1 ) 10382 - 10382 2018年
Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. 査読有り 国際誌
Tadato Ban, Takaya Ishihara, Hiroto Kohno, Shotaro Saita, Ayaka Ichimura, Katsumi Maenaka, Toshihiko Oka, Katsuyoshi Mihara, Naotada Ishihara
Nature cell biology19 ( 7 ) 856 - 863 2017年7月
Constitutive Activation of PINK1 Protein Leads to Proteasome-mediated and Non-apoptotic Cell Death Independently of Mitochondrial Autophagy 査読有り
Shiori Akabane, Kohei Matsuzaki, Shun-ichi Yamashita, Kana Arai, Kei Okatsu, Tomotake Kanki, Noriyuki Matsuda, Toshihiko Oka
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY291 ( 31 ) 16162 - 16174 2016年7月
PKA Regulates PINK1 Stability and Parkin Recruitment to Damaged Mitochondria through Phosphorylation of MIC60 査読有り
Shiori Akabane, Midori Uno, Naoki Tani, Shunta Shimazaki, Natsumi Ebara, Hiroki Kato, Hidetaka Kosako, Toshihiko Oka
MOLECULAR CELL62 ( 3 ) 371 - 384 2016年5月
Unconventional PINK1 localization to the outer membrane of depolarized mitochondria drives Parkin recruitment 査読有り
Kei Okatsu, Mayumi Kimura, Toshihiko Oka, Keiji Tanaka, Noriyuki Matsuda
JOURNAL OF CELL SCIENCE128 ( 5 ) 964 - 978 2015年3月
A dimeric pink1-containing complex on depolarized mitochondria stimulates parkin recruitment 査読有り
Kei Okatsu, Midori Uno, Fumika Koyano, Etsu Go, Mayumi Kimura, Toshihiko Oka, Keiji Tanaka, Noriyuki Matsuda
Journal of Biological Chemistry288 ( 51 ) 36372 - 36384 2013年12月20日
Fis1 acts as a mitochondrial recruitment factor for TBC1D15 that is involved in regulation of mitochondrial morphology. 査読有り 国際誌
Kenta Onoue, Akihiro Jofuku, Reiko Ban-Ishihara, Takaya Ishihara, Maki Maeda, Takumi Koshiba, Takashi Itoh, Mitsunori Fukuda, Hidenori Otera, Toshihiko Oka, Hiroyoshi Takano, Noboru Mizushima, Katsuyoshi Mihara, Naotada Ishihara
Journal of cell science126 ( Pt 1 ) 176 - 85 2013年1月1日
PINK1 autophosphorylation upon membrane potential dissipation is essential for Parkin recruitment to damaged mitochondria 査読有り
Kei Okatsu, Toshihiko Oka, Masahiro Iguchi, Kenji Imamura, Hidetaka Kosako, Naoki Tani, Mayumi Kimura, Etsu Go, Fumika Koyano, Manabu Funayama, Kahori Shiba-Fukushima, Shigeto Sato, Hideaki Shimizu, Yuko Fukunaga, Hisaaki Taniguchi, Masaaki Komatsu, Nobutaka Hattori, Katsuyoshi Mihara, Keiji Tanaka, Noriyuki Matsuda
NATURE COMMUNICATIONS3 2012年8月
KLP6: a newly identified kinesin that regulates the morphology and transport of mitochondria in neuronal cells 査読有り
Kousuke Tanaka, Yoshimi Sugiura, Ryohei Ichishita, Katsuyoshi Mihara, Toshihiko Oka
JOURNAL OF CELL SCIENCE124 ( 14 ) 2457 - 2465 2011年7月
Characterization of the mitochondrial protein LETM1, which maintains the mitochondrial tubular shapes and interacts with the AAA-ATPase BCS1L 査読有り
Shoko Tamai, Hiroshi Iida, Sadaki Yokota, Tomoko Sayano, Shoko Kiguchiya, Naotada Ishihara, Jun-Ichi Hayashi, Katsuyoshi Mihara, Toshihiko Oka
JOURNAL OF CELL SCIENCE121 ( 15 ) 2588 - 2600 2008年8月
Identification of a novel protein MICS1 that is involved in maintenance of mitochondrial morphology and apoptotic release of cytochrome c 査読有り
Toshihiko Oka, Tomoko Sayano, Shoko Tamai, Sadaki Yokota, Hiroki Kato, Gen Fujii, Katsuyoshi Mihara
MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL19 ( 6 ) 2597 - 2608 2008年6月
An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans 査読有り
Ryohei Ichishita, Kousuke Tanaka, Yoshimi Sugiura, Tomoko Sayano, Katsuyoshi Mihara, Toshihiko Oka
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY143 ( 4 ) 449 - 454 2008年4月
Mitotic Phosphorylation of Dynamin-related GTPase Drp1 Participates in Mitochondrial Fission 査読有り
Naoko Taguchi, Naotada Ishihara, Akihiro Jofuku, Toshihiko Oka, Katsuyoshi Mihara
Journal of Biological Chemistry282 ( 15 ) 11521 - 11529 2007年4月
J.-y. Kinoshita, K. Mihara, T. Oka
Journal of Biochemistry141 ( 6 ) 897 - 906 2007年3月27日
Otera H, Taira Y, Horie C, Suzuki Y, Suzuki H, Setoguchi K, Kato H, Oka T, Mihara K
Journal of Cell Biology179 ( 7 ) 1355 - 1363 2007年
Yuka Eura, Naotada Ishihara, Toshihiko Oka, Katsuyoshi Mihara
Journal of Cell Science119 ( 23 ) 4913 - 4925 2006年12月1日
IntraGolgi distribution of the Conserved Oligomeric Golgi (COG) complex 査読有り
Eliza Vasile, Toshihiko Oka, Maria Ericsson, Nobuhiro Nakamura, Monty Krieger
Experimental Cell Research312 ( 16 ) 3132 - 3141 2006年10月
Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1 査読有り
Naotada Ishihara, Yuu Fujita, Toshihiko Oka, Katsuyoshi Mihara
The EMBO Journal25 ( 13 ) 2966 - 2977 2006年7月12日
Subunit Architecture of the Conserved Oligomeric Golgi Complex 査読有り
Daniel Ungar, Toshihiko Oka, Eliza Vasile, Monty Krieger, Frederick M. Hughson
Journal of Biological Chemistry280 ( 38 ) 32729 - 32735 2005年9月
Toshihiko Oka, Eliza Vasile, Marsha Penman, Carl D. Novina, Derek M. Dykxhoorn, Daniel Ungar, Frederick M. Hughson, Monty Krieger
Journal of Biological Chemistry280 ( 38 ) 32736 - 32745 2005年9月
The COG and COPI Complexes Interact to Control the Abundance of GEARs, a Subset of Golgi Integral Membrane Proteins 査読有り
Toshihiko Oka, Daniel Ungar, Frederick M. Hughson, Monty Krieger
Molecular Biology of the Cell15 ( 5 ) 2423 - 2435 2004年5月
From Lysosomes to the Plasma Membrane 査読有り
Takao Toyomura, Yoshiko Murata, Akitsugu Yamamoto, Toshihiko Oka, Ge-Hong Sun-Wada, Yoh Wada, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry278 ( 24 ) 22023 - 22030 2003年6月
Daniel Ungar, Toshihiko Oka, Elizabeth E. Brittle, Eliza Vasile, Vladimir V. Lupashin, Jon E. Chatterton, John E. Heuser, Monty Krieger, M. Gerard Waters
Journal of Cell Biology157 ( 3 ) 405 - 415 2002年4月29日
V-o and V-1 subunit isoforms of mouse vacuolar proton ATPase V1Vo 査読有り
GH Sun-Wada, T Yoshimizu, Y Murata, T Oka, Y Wada, M Futai
FASEB JOURNAL16 ( 4 ) A154 - A154 2002年3月
Structure and properties of isoforms of mouse vacuolar proton ATPase subunits
GH Sun-Wada, T Yoshimizu, Y Murata, T Oka, Y Wada, M Futai
MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL12 251A - 251A 2001年11月
a4, a Unique Kidney-specific Isoform of Mouse Vacuolar H+-ATPase Subunit a 査読有り
Toshihiko Oka, Yoshiko Murata, Miwako Namba, Takao Yoshimizu, Takao Toyomura, Akitsugu Yamamoto, Ge-Hong Sun-Wada, Naotaka Hamasaki, Yoh Wada, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry276 ( 43 ) 40050 - 40054 2001年10月
Four Subunit a Isoforms ofCaenorhabditis elegans Vacuolar H+-ATPase 査読有り
Toshihiko Oka, Takao Toyomura, Kenta Honjo, Yoh Wada, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry276 ( 35 ) 33079 - 33085 2001年8月
Requirement of V-ATPase for Ovulation and Embryogenesis inCaenorhabditis elegans 査読有り
Toshihiko Oka, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry275 ( 38 ) 29556 - 29561 2000年9月
G.-H. Sun-Wada, S. Manabe, T. Yoshimizu, C. Yamaguchi, T. Oka, Y. Wada, M. Futai
Journal of Biochemistry127 ( 4 ) 703 - 709 2000年4月1日
Three Subunit a Isoforms of Mouse Vacuolar H+-ATPase 査読有り
Takao Toyomura, Toshihiko Oka, Chie Yamaguchi, Yoh Wada, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry275 ( 12 ) 8760 - 8765 2000年3月
Disruption of clh-1, a chloride channel gene, results in a wider body of Caenorhabditis elegans 査読有り
Mark I.R Petalcorin, Toshihiko Oka, Makoto Koga, Ken-ichi Ogura, Yoh Wada, Yasumi Ohshima, Masamitsu Futai
Journal of Molecular Biology294 ( 2 ) 347 - 355 1999年11月
Hidenobu Uchida, Lena Suzuki, Toyoaki Anai, Koji Doi, Hiroyoshi Takano, Hirofumi Yamashita, Toshihiko Oka, Shigeyuki Kawano, Ken-Ichi Tomizawa, Tamotsu Kawazu, Haruko Kuroiwa, Tsuneyoshi Kuroiwa
Current Genetics36 ( 4 ) 232 - 240 1999年10月13日
Y. Saito, T. Yamanushi, T. Oka, A. Nakano
Journal of Biochemistry125 ( 1 ) 130 - 137 1999年1月1日
Identification and Cloning of Rat Galectin-2: Expression Is Predominantly in Epithelial Cells of the Stomach 査読有り
Toshihiko Oka, Seiko Murakami, Yoichiro Arata, Jun Hirabayashi, Ken-Ichi Kasai, Yoh Wada, Masamitsu Futai
Archives of Biochemistry and Biophysics361 ( 2 ) 195 - 201 1999年1月
Tokumitsu Wakabayashi, Norihiro Nakamura, Yoshihiro Sambongi, Yoh Wada, Toshihiko Oka, Masamitsu Futai
FEBS Letters440 ( 1-2 ) 141 - 146 1998年11月27日
Y. Saito, K. Kimura, T. Oka, A. Nakano
Journal of Biochemistry124 ( 4 ) 816 - 823 1998年10月1日
Multiple Genes for Vacuolar-type ATPase Proteolipids inCaenorhabditis elegans 査読有り
Toshihiko Oka, Ryuji Yamamoto, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry273 ( 35 ) 22570 - 22576 1998年8月
Three vha Genes Encode Proteolipids ofCaenorhabditis elegans Vacuolar-type ATPase 査読有り
Toshihiko Oka, Ryuji Yamamoto, Masamitsu Futai
Journal of Biological Chemistry272 ( 39 ) 24387 - 24392 1997年9月
Y. Sambongi, T. Wakabayashi, T. Yoshimizu, H. Omote, T. Oka, M. Futai
Journal of Biochemistry121 ( 6 ) 1169 - 1175 1997年6月1日
T. Yamanush, A. Hirata, T. Oka, A. Nakano
Journal of Biochemistry120 ( 2 ) 452 - 458 1996年8月1日
The Rat Intrinsic Factor Gene: Its 5′-Upstream Region and Chief Cell-Specific Transcription1 査読有り
Masatomo Maeda, Seikyo Asahara, Tsuyoshi Nishi, Sotaro Mushiake, Toshihiko Oka, Shoichi Shimada, Tsutomu Chiba, Masaya Tohyama, Masamitsu Futai
The Journal of Biochemistry117 ( 6 ) 1305 - 1311 1995年6月
Identification of the Promoter Region of the Human Histamine H2-Receptor Gene 査読有り
T. Nishi, T. Koike, T. Oka, M. Maeda, M. Futai
Biochemical and Biophysical Research Communications210 ( 2 ) 616 - 623 1995年5月
Akihiko Nakano, Hideshi Otsuka, Mami Yamagishi, Eiichi Yamamoto, Keitaro Kimura, Shuh-ichi Nishikawa, Toshihiko Oka
The Journal of Biochemistry116 ( 2 ) 243 - 247 1994年8月
Inhibition of GTP hydrolysis by Sar1p causes accumulation of vesicles that are a functional intermediate of the ER-to-Golgi transport in yeast 査読有り
Toshihiko Oka, Akihiko Nakano
Journal of Cell Biology124 ( 4 ) 425 - 434 1994年
Reconstitution of GTP-binding Sar1 protein function in ER to Golgi transport. 査読有り
Toshihiko Oka, Shuh-ichi Nishikawa, Akihiko Nakano
Journal of Cell Biology114 ( 4 ) 671 - 679 1991年8月15日
Insights into the regulation of mitochondrial functions by PKA-mediated phosphorylation. 招待有り 国際誌
Shiori Akabane, Toshihiko Oka
Journal of biochemistry 2023年9月29日
PKAはMIC60のリン酸化を介してPINK1とParkinによるミトコンドリア品質管理を制御する 招待有り
赤羽しおり, 岡 敏彦
実験医学 2016年
ミトコンドリア形態異常と疾患 招待有り
岡 敏彦
医学のあゆみ 2015年
Regulation and Physiologic Functions of GTPases in Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals 招待有り
Naotada Ishihara, Hidenori Otera, Toshihiko Oka, Katsuyoshi Mihara
ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING19 ( 4 ) 389 - 399 2013年8月
ミトコンドリア膜構造変化とアポトーシス制御 招待有り
大寺秀典, 岡 敏彦
細胞工学 2010年
Retrograde transport on the COG railway 招待有り
D Ungar, T Oka, M Krieger, FM Hughson
TRENDS IN CELL BIOLOGY16 ( 2 ) 113 - 120 2006年2月
A railroad switch in mitochondrial protein import 招待有り
T Oka, K Mihara
MOLECULAR CELL18 ( 2 ) 145 - 146 2005年4月
Multi-component protein complexes and Golgi membrane trafficking 招待有り
T Oka, M Krieger
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY137 ( 2 ) 109 - 114 2005年2月
Oligosaccharide specificity of galectins: a search by frontal affinity chromatography
Jun Hirabayashi, Tomomi Hashidate, Yoichiro Arata, Nozomu Nishi, Takanori Nakamura, Mitsuomi Hirashima, Tadasu Urashima, Toshihiko Oka, Masamitsu Futai, Werner E.G Muller, Fumio Yagi, Ken-ichi Kasai
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects1572 ( 2-3 ) 232 - 254 2002年9月
Luminal acidification of diverse organelles by V-ATPase in animal cells
M. Futai, T. Oka, G. Sun-Wada, Y. Moriyama, H. Kanazawa, Y. Wada
Journal of Experimental Biology203 ( 1 ) 107 - 116 2000年1月1日
Diverse Roles of Single Membrane Organelles: Factors Establishing the Acid Lumenal pH
M. Futai, T. Oka, Y. Moriyama, Y. Wada
Journal of Biochemistry124 ( 2 ) 259 - 267 1998年8月1日
Purification and assay of yeast Sarlp
Keitarou Kimura, Toshihiko Oka, Akihiko Nakano
Small GTPases and Their Regulators Part C: Proteins Involved in Transport 41 - 49 1995年
酵母における小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送
岡 敏彦, 中野明彦
新生化学実験講座第6巻生体膜と膜輸送下 615 - 623 1992年
ミトコンドリア外シグナルによるミトコンドリア品質管理の制御機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2020年4月 - 2023年3月
課題番号:20H03257
配分額:17810000円 ( 直接経費:13700000円 、 間接経費:4110000円 )
ミトコンドリアは多彩な細胞機能を担っており,その機能は細胞により様々な調節を受けている。特に,オートファジーを介した障害を受けたミトコンドリアの排斥は,ミトコンドリア品質管理として,近年,その詳細な分子メカニズムが明らかになってきた。私達は,PINK1/Parkinを介したミトコンドリアの品質管理が,cAMP/PKA経路によるリン酸化修飾で調節されることを証明した。これにより,様々なミトコンドリア外のシグナル経路が品質管理を調節する可能性が示された。本研究では,ミトコンドリア外シグナルによるミトコンドリア品質管理調節機構の分子メカニズムの全体像の理解を目指す。令和3年度は,次の2点について研究を進めた。
1.ミトコンドリア外膜上におけるヘキソキナーゼの機能を解析するために,3種類のアイソフォーム(HK1, HK2, HK4)を用いて,その酵素活性と細胞内局在の関連性を蛍光抗体法により解析した結果,HK1はミトコンドリアに,HK4は細胞質に,HK2はミトコンドリアと細胞質に局在することが明らかとなった。さらに,酵素活性を失ったHK2変異体は,ミトコンドリア局在を示さなかったことから,酵素活性に依存したミトコンドリアへの標的化機構が示唆された。
2.ヘキソキナーゼアイソフォームHK2のタンパク質複合体の形成に関わる因子を検索するために,ミトコンドリアの脱分極に依存してヘキソキナーゼに結合するタンパク質の同定を試みたが,まだ特異的なタンパク室の同定には至っていない。
リン酸化修飾によるミトコンドリア機能と品質管理の制御機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2017年4月 - 2020年3月
課題番号:17H03676
配分額:17420000円 ( 直接経費:13400000円 、 間接経費:4020000円 )
障害を受け膜電位が低下したミトコンドリアのオートファジーによる排斥は,ミトコンドリア品質管理として近年注目を浴びている。しかし,ミトコンドリア品質管理が細胞からどのように調節されているかは不明な点が多く残る。私達は,リン酸化修飾を介したミトコンドリアの機能制御と品質管理に着目し,ミトコンドリアタンパク質のリン酸化反応の場所やリン酸化酵素PKAの触媒サブユニットアイソフォームの細胞内局在を明らかにした。また,解糖系酵素のミトコンドリア品質管理への関与も示した。
PINK1によるミトコンドリアの形態制御と機能調節
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2014年4月 - 2017年3月
課題番号:26440106
配分額:5200000円 ( 直接経費:4000000円 、 間接経費:1200000円 )
ミトコンドリアは細胞の主要なATP産生の場であり,その機能とダイナミックな形態変化の関連は,近年注目されている。私達は線虫と動物細胞を用いて,ミトコンドリアの品質管理を制御するPINK1が①ミトコンドリア形態も制御していること,及び②ネクローシス様の細胞死を引き起こすことを見出した。特に,PINK1による細胞死は既存のメカニズムとは異なる機構で引き起こされており,パーキンソン病におけるドーパミン作動性神経の変性との関連性も興味深い。
再構成系を用いたミトコンドリア分裂機構の解析
日本学術振興会 科学研究費助成事業
三原 勝芳, 岡 敏彦, 大寺 秀典
2012年4月 - 2014年3月
課題番号:24657138
配分額:4160000円 ( 直接経費:3200000円 、 間接経費:960000円 )
ミトコンドリア(Mt)は融合と分裂によって頻繁に構造を変化させる。融合には外膜のMfn1,Mfn2と内膜のOPA1が、分裂には細胞質のDrp1が関与している。今回はDrp1がMtに集積して分裂を実行する過程を解析し(1)分裂には外膜Mffに加えMid49, Mid51がDrp1受容体として機能するがMffが最も主要な受容体であることを明らかにした。(2)Mff-KOマウスを作成。Drp1-KOマウスよりも早く初期胚で死亡する。受容体機能に加え重要な機能を持つことが推測された。3)Drp1がmtDMA分配に関連する、心筋の配列形成に必須である、肝臓での欠失はNASHを発症することを明らかにした。
ミトコンドリア形態と細胞内運搬の制御機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2011年 - 2013年
課題番号:23570232
配分額:5460000円 ( 直接経費:4200000円 、 間接経費:1260000円 )
本研究では,線虫体壁筋のミトコンドリア形態を指標に,その制御に関わるキネシンKLP-6 を同定した。HeLa細胞やマウス神経芽細胞においても,KLP6がミトコンドリア形態,特にミトコンドリア輸送に働くことを示した。
また,ミトコンドリア内膜タンパク質LETM1を用いて,人工リポソーム上に膜陥入構造を再構成した。これにより,ミトコンドリアのクリステ構造を詳細に検討できる手法を確立できた.
ミトコンドリアダイナミクスの制御機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
三原 勝芳, 大寺 秀典, 石原 直忠, 岡 敏彦
2010年 - 2012年
課題番号:22370071
配分額:18850000円 ( 直接経費:14500000円 、 間接経費:4350000円 )
(1)ミトコンドリア(Mt)の分裂に関わる細胞質の因子Drp1のノックアウト(KO)マウスの作成に始めて成功し、全身Drp1-KOならびに神経Drp1-KOマウスの個体ならびに細胞での表現系の解析を行った。さらに肝臓、膵臓beta-細胞、心筋、卵巣でのDrp1-KOマウスを作製し解析を行っている。
(2)Mt外膜上のDrp1受容体は不明で会ったが我々は従来考えられていたFis1ではなく新規な外膜蛋白質Mffが受容体として働くことを始めて明らかにした。
(3)神経のMt軸索輸送に関わる新規な因子KLP6の同定に成功した。
(4) Rab-GAPタンパク質TBC1D15がその受容体であることを明らかにした。
(5) rp1の機能を抑制するとマトリクス内のmDNA-タンパク質複合体のサイズが増大する現象を見いだし、これがクリステ構造を安定化することでアポトーシスを抑制することを見出した。
ミトコンドリア分裂・融合因子の作動機序
日本学術振興会 科学研究費助成事業
三原 勝芳, 岡 敏彦, 大寺 秀典
2010年 - 2011年
課題番号:22020026
配分額:6400000円 ( 直接経費:6400000円 )
ミトコンドリア(Mt)は外膜、内膜2枚の膜に囲まれ細胞における好気的ATP産生、アポトーシス、カルシウムシグナリングなどに関わる真核細胞に必須のオルガネラであり、細胞の環境や病態に応じて融合・分裂を介してダイナミックに形態を変化させるが、この動態の調節は細胞の生と死に重要な役割を果たす。この調節には4つの高分子量GTPaseが主要な因子として関与する;細胞質に局在しMtにリクルートされてMt分裂を行うDrp1、外膜の融合に関わるMfn1とMfn2、ならびに内膜の融合とクリステ構造維持に関わる膜間部のOPA1(内膜結合)である。本申請は哺乳類Mtの融合・分裂の分子機構を明らかにすることを目的とし、平成23年度は以下の事柄を明らかにした。
(1)Mtの分裂に関わる細胞質の因子Drp1の全身Drp1-KOならびに神経Drp1-KOマウスの作成に続いて肝臓、膵臓β細胞、心筋、卵巣でのDrp1-KOマウスを作製し解析を行っている。膵臓β細胞では2型糖尿病の、心筋では心筋梗塞の症状を示しまた卵巣では卵の分裂停止を惹起することが明らかになった(投稿準備中)。(2)Mt外膜上のDrp1受容体の実態は長らく不明であったが、我々は従来考えられていたFis1ではなく新規な外膜蛋白質MffがDrp1受容体として働くことを明らかにし現在反応機構解析を行っている。(3)Mffの高次機能を解明する目的でMff-KOマウスの作成に着手しES細胞を胚盤胞に注入しキメラマウスを作成する段階に到っている。
ミトコンドリア形態制御因子の網羅的検索とその機能解析
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2008年 - 2010年
課題番号:20570185
配分額:4940000円 ( 直接経費:3800000円 、 間接経費:1140000円 )
ミトコンドリアの形態形成・維持に働く因子を網羅的に検索するため、線虫を用いてRNA干渉法により、ほぼ全てのミトコンドリアタンパク質遺伝子と分子モーター遺伝子をスクリーニングした。その結果、新規遺伝子MICS1とKLP6を見出しそれぞれがミトコンドリアの内膜構造維持と細胞内移動に働くことを明らかにした。
メンブレンモルフォテクノロジー(膜形態工学)-ひだ状人工膜の構築を目指して
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
2008年 - 2010年
課題番号:20200058
配分額:29900000円 ( 直接経費:23000000円 、 間接経費:6900000円 )
細胞内には固有の形態を持つ様々なオルガネラがあり、その形態は細胞の種類、外的環境、細胞周期などの条件により大きく変化する。本研究では、実際にオルガネラの形態を決める要因(管状、球状、ひだ状)の一つであるひだ状膜構造を人工膜上に再構成することで、その膜環境で働くタンパク質の機能をより生理的な条件下で解析し、また生体膜の物性を詳細に検討することを目指した。これらの成果により、オルガネラ形態の機能的意味の手掛かりを得たいと考えた。
ミトコンドリア内膜が陥入し折りたたまれた膜構造(クリステ構造)に必須なタンパク質LETM1を用い、人工膜リボソーム上に折りたたみ構造の再構成を試み、球状のリボソーム膜が多重に内側に落ち込んだ構造体を再構成することに成功した。
ミトコンドリア外膜の生合成と分裂・融合の分子機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
三原 勝芳, 岡 敏彦, 大寺 秀典
2008年 - 2010年
課題番号:20059024
配分額:7000000円 ( 直接経費:7000000円 )
ミトコンドリア(Mt)は外膜、内膜2枚の膜に囲まれ細胞における好気的なATP産生、アポトーシス、カルシウムシグナル伝達などに関わる必須のオルガネラである。本申請は特にインターフェースとして様々な機能が集積しているMtの外膜に焦点を絞り、外膜を構成する蛋白質のMtへの配送、蛋白質輸送装置による外膜蛋白質の外膜への組み込み、ならびに外膜の分裂融合装置によるMt膜ダイナミクスの制御機構を明らかにすることを目的とし、以下の事柄を明らかにした。
(1)ミトコンドリアDNAにコードされる蛋白質のマトリクス側から内膜への組み込みに関わる因子OXA1を同定し、この内膜組み込みの機構を明らかにした。さらに最初の膜貫通領域の直上に膜間部へのエクスポートに必須な領域があることを見いだした。(2)高分子量GTPase Drp1は通常細胞質に分布し、Mt表面にリクルートされてのMtの分裂に関わる因子であるがその生理的な重要性は不明であった。我々はDrp1遺伝子のノックアウトマウス作成に初めて成功し、個体ならびに細胞レベルでの表現形の解析を行なった。その結果Drp1は神経のシナプス形成に必須であることを明らかにした。(3)Mtの軸索輸送に関わる新規な因子KLP6の同定に成功した。
(4) Mt外膜上のDrp1受容体は不明であったが我々は従来推定されていたFis1ではなくMffと呼ばれる外膜因子が受容体として働くことを初めて明らかにした。
ミトコンドリア外膜タンパク質のプロテアソーム分解とその生理的役割
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦, 大寺 秀典
2007年 - 2008年
課題番号:19044033
配分額:6100000円 ( 直接経費:6100000円 )
1) ミトコンドリア上でのユビキチン化Tom20とその制を因子の解析
Tom20はTom22非存在下でミトコンドリア膜上でのユビキチン化されていた。プロテアソーム阻害剤存在下で、ユビキチン化Tom20はミトコンドリア膜上に蓄積しており、膜から引き抜かれる際のどのような因子が必要かを検討したとこと、小胞体での膜タンパク質分解に関与するp97は必要でなかった。
2) 低酸素条件下でのTom20の分解
筋繊維ではTom20が虚血(低酸素条件下)で特異的に分解される報告がある。培養細胞においても、ガスパックにより酸素を減らすことでTom20の分解が促進されることを確認している。この分解がプロテアソーム依存であるのかを検討したが、この分解はプロテアソーム阻害剤により阻害されなかった。
3) Tom20をユビキチン化する酵素
これまでミトコンドリア機能に影響を与えることが知られているMarchV/MITOLや新規タンパク質MAPL/MULANなどのミトコンドリアユビキチンリガーゼは、Tom20の分解に関与しないことがこれまでの私たちの研究で明らかとなった。さらに今回、酵母Mdm30p(F-boxタンパク質)の相同遺伝子であるFbx3やCullinもまた、RNA干渉法ではTom20の分解への影響は見られなかった。
様々な酸性環境を作り出す液胞型ATPaseの役割と機能
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
線虫における液胞型ATPaseの役割とクロライドイオンによる調節
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
1999年 - 2000年
課題番号:11780445
配分額:2200000円 ( 直接経費:2200000円 )
本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。
1)新たな線虫V-ATPase遺伝子の同定
本研究では、V-ATPaseの作り出す多様な酸性環境の役割を明らかにするために、複数存在するV-ATPaseサブユニットのアイソフォームに着目し、アイソフォームが酸性環境の多様性にどう影響しているかを理解しようとしている。そのために、線虫でアイソフォーム遺伝子の欠損変異体の作成、解析を行い、その構築している酸性環境を同定することを目指している。そのために、線虫のデータベースより、V-ATPaseサブユニットaに似たESTクローンを検索し、4種類のクローンを同定した。ESTクローンと5'-RACE法で得られたPCR産物の塩基配列を決定し、全長のcDNAの配列を明らかにした。これかV-ATPaseサブユニットaイソフォーム遺伝子(vha-5,vha-6,vha-7,unc-32)は、それぞれ873,865,966,894アミノ酸残基より成るタンパク質をコードしていた。
2)線虫V-ATPase変異体の構築
平成12年度は、新らたに同定したV-ATPaseサブユニット遺伝子)の欠損変異体の構築を目指した。まず2本鎖RNA(dsRNA)を用いたRNA interference法により一時的にvha遺伝子の発現を遮断し、目的とする欠損変異体の表現型を解析した。vha-5遺伝子のdsRNAを成虫に導入することにより、その子孫が2令幼虫期で死滅したことから、vha-5遺伝子が線虫の3令幼虫への発生に重要な役割を担っていることが示唆された。また、vha-6やunc-32遺伝子のdsRNAを導入すると、1令幼虫や胚の段階で発生が押さえられ死滅することが分かった。vha-7遺伝子のdsRNA導入では子孫に何の変化も見られなかった。これら原因としては、それぞれの発生段階で特異的なサブユニット構成のV-ATPaseの活性が必要とされていることが推定される。現在は、これら遺伝子の機能欠損による致死の原因を分子レベルで検討中である。
胃におけるGATA転写因子の制御機構とクロライドイオン輸送の解析
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
1998年 - 1999年
課題番号:09780575
配分額:1800000円 ( 直接経費:1800000円 )
本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。
1、 転写囚子GATA-GTlまたはGATA-GT2と相互作用するタンパク質の検索
融合タンパク質を用いた因子の検索:GATA-GTl、GATA-GT2と直接的に相互作用するタンパク質を調べるために、HA(ヘマグルチニン)タグを付けたGATA-GTlまたはGATA-GT2との融合タンパク質を大腸菌で大量に調製した。そのれら融合タンパク質をプローブとして、胃粘膜組織より調製したcDNAライブラリーの発現系を用いて、相互作用するタンパク質の分離を行なった。スクリーニングにより複数の陽性クローンを分離し、その塩基配列の決定した。幾つかの新規のクローンの中に、ノーザンブロットなどにより組織特異的発現が観察されるものがあった。現在は酵母Two-hybrid法滋を用いて相互作用に必要な領域を検討中である。
2、 胃におけるクロライドイオンの輸送とそのチャンネルの同定
胃のクロライドチャンネルを同定するために、アフリカツメガエルの卵を用いた発現クローニングを行なった。胃粘膜より調製したcDNAをアフリカツメガエルの卵に打ち込み、クロライドイオンの透過を電気生理学的に測定したが、これまでに特異的なクローンは得られていない。胃粘膜のcDNAの再調製と測定感度について再度検討しなおしたが、チャンネル活性を示すクローンは同定できなかった。
高等植物における液胞形成の制御と組織構築
日本学術振興会 科学研究費助成事業
和田 洋, 岡 敏彦, 表 弘志
1998年 - 1998年
課題番号:10182208
配分額:3000000円 ( 直接経費:3000000円 )
液胞はその内部を酸性に保ち,液胞膜を介した化学浸透圧的エネルギー差を利用して代謝産.物・無機イオンを輸送する.高等植物の液胞膜を介した化学浸透圧エネルギー差は,H^+-ATPase,H^+-PPaseの二種のイオンポンプの機能による,本研究では、高等植物の形態・組織構築に果たす液胞の生理的機能を明らかに.する研究の一環としてオルガネラ酸性化の制御機構に焦点を結び,細胞基質と液胞のイオン環境の調節を分子レベルで解析する系の構築を進めた.シロイヌナズナの液胞膜H^+-PPaseのcDNA(AVP3)をライブラリーから取得し,これを出芽酵母の構成的かつ強発現性プロモータの下流において出芽酵母に導入した.細胞分画法・蛍光抗体法の両手法で,66-kDaのシロイヌナズナH^+-PPaseが出芽酵母の液胞に発現されることを確認した.この形質転換酵母より液胞膜小胞を単離し,ATP(出芽酵母内在性のH^+-ATPaseを駆動する),およびPPi(シロイヌナズナH^+-PPKSeを駆動する)依存に形成されるpH差.膜電位差を色素の蛍光クエンチングを指標に測定した.ATPase、PPaseの両者をもつ液胞膜小胞は,ATPもしくはPPi単独でH^+輸送を駆動したときよりも,ATP+PPiで駆動した場合の方が,大きなpH差を形成するが,一方,膜電位差は大きくは変わらない.このことは,液胞膜のイオン環境の制御には,膜電位差が重要な,おそらく制限的な因子として作用していることを示している.
マラリア原虫における細胞内小胞輸送の分子機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
和田 洋, 岡 敏彦, 表 弘志
1998年 - 1998年
課題番号:10166204
配分額:1700000円 ( 直接経費:1700000円 )
マラリア原虫の血球内生育サイクルにおいて,エンドサイトーシス・エクソサイトーシスといった細胞膜と細胞内小器官膜との間の小胞輸送過程が,原虫のエネルギー獲得と物質の取り込みに必須な役割を果たす.したがって,小胞輸送過程の分子機構の解明は,マラリア原虫の生育生理を理解する上で極めて重要であるのみならず,マラリア制圧に向けた新奇の戦略を構想する点においても重要である.しかしながら,本生物の細胞内小胞輸送の分子機構はほとんど明らかにされていない.細胞内小胞輸送に直接的に関与する分子として,N-ethylmaleimide sensitive fusion protcin(NSF)がPlasmodium falciparumのゲノム上に存在することを,Genomedatabaseの検索の結果,明らかにした.この分子の機能を,まず,出芽酵母発現系を用いて解析することを考え,酵母発現ベクターに遺伝子断片を組み込むことを進めている.しかしながら,Plasmodiumの遺伝子のAT-richである特性のため,通常の遺伝子操作法では特異的遺伝子断片の取得と同定が困難であり,現在のところ酵母での発現にまで至っていない.
ATP駆動型プロトントランスポーターとCI-チェンネルの構造・機能・協関
日本学術振興会 科学研究費助成事業
二井 將光, 岡 敏彦
1997年 - 1997年
課題番号:09257228
配分額:1800000円 ( 直接経費:1800000円 )
ATPの分解によって駆動されるプロトントランスポーターとクロライドチャネルについて詳細な研究を展開し、以下にまとめた主な成果を得た。
1)F_0F_1ATPaseのプロトン・チャネル部分であるF_0部分を精製し、リポソームに埋め込み原子力間顕微鏡によって観察した。その結果、直径約130Åで中央部に深さが約18Åのくぼみがある構造を観察した。原子力間顕微鏡の限界を考慮し、この構造がF_0であることを確認した。さらにF_0を形成しているサブユニットの一つであるaサブユニットについて膜外にあると推定される四個所に対応するSite-directed抗体を作成し、F_0部分に関する反応性を検討した。これらの結果から3種のサブユニットからなるF_0部分のモデルを提出した。
2)リソソーム、エンドソームに局在する液胞型プロトンポンプが膀胱の最表層の細胞に存在することを示した。このポンプが実際に尿を酸性化していることを示した。
3)線虫においては3つの遺伝子(vha1,vha2,vha3)が液胞型プロトン・ポンプ(液胞型ATPase)のプロトン・チャネルをコードしていること、これらが線虫の発生に伴なってStage-Specificに、しかも細胞特異的に発現しているを示した。さらに線虫に存在するClC型のクロライドチャネルに対応するcDNAをすべてクローン化し、これらの機能を解析した。
胃壁細胞におけるプロトンポンプの転写機構とクロライドイオン輸送の解析
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
1996年 - 1996年
課題番号:08780587
配分額:1000000円 ( 直接経費:1000000円 )
本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。
1、転写因子GATA-GT1またはGATA-GT2と相互作用するタンパク質の検索
融合タンパク質を用いた因子の検索:GATA-GT1、GATA-GT2と直接的に相互作用するタンパク質を調べるために、HA(ヘマグルチニン)タグを付けたGATA-GT1またはGATA-GT2との融合タンパク質を大腸菌で大量に調製した。そのれら融合タンパク質をプローブとして、胃粘膜組織より調製したcDNAライブラリーの発現系を用いて、相互作用するタンパク質の分離を行なっている。現在までに、複数の陽性クローンを分離できた。さらに、この方法によって分離されたクローンの塩基配列の決定を進めるとともに、ノーザンブロットなどを用いて得たクローンを選別していく予定である。
2、胃におけるクロライドイオンの輸送とそのチャンネルの同定
胃のクロライドチャンネルを同定するために、アフリカツメガエルの卵を用いた発現クローニングを行なった。胃粘膜より調製したcDNAをアフリカツメガエルの卵に打ち込み、クロライドイオンの透過を電気生理学的に測定したが、現在までにこの方法により、特異的なクローンは得られていない。今後は、胃粘膜のcDNAの再調製と測定感度について再度検討しなおし、チャンネルを同定を進めていく予定である。
ATP駆動型プロトントランスポーターとCl^-チャンネルの構造・機能・協関
日本学術振興会 科学研究費助成事業
二井 將光, 岡 敏彦
1996年 - 1996年
課題番号:08268232
配分額:1500000円 ( 直接経費:1500000円 )
ATPによって駆動される、H^+トランスポーターについて詳細な研究を展開した。本年度は特に、液胞型ATPaseとF型ATPaseを中心に以下の成果を得た。
(1)F型ATPaseのプロトン輸送路サブユニットの1つである、アブユニットaの膜を横切るトポロジーを決定した。また、原子間力顕微鏡(AFM)によってFoの全体的な構造を明らかにした。
(2)液胞型ATPaseのプロトン輸送路を形成しているサブユニットの遺伝子が、線虫には3種存在していること、発現に細胞特異的性があることを示した。液胞型ATPaseと協同して、液胞系オルガネラ内部pHを調節しているCl^-チャネルに関して線虫を中心に研究を進め、遺伝子およびcDNAをクローン化し、欠失動物を作製した。
(3)液胞型ATPaseが膀胱の最外層の細胞の形質膜に存在し、膀胱内部を酸性化していることを明らかにした。
H^+ATPaseによるH^+輸送調節機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
二井 將光, 岡 敏彦, 三本木 至宏, 表 弘志
1995年 - 1996年
課題番号:07458159
配分額:7300000円 ( 直接経費:7300000円 )
ATPを分解するエネルギーと共役してH^+を輸送する膜酵素(H^+ATPase)、およびH^+の電気化学的ポテンシャル差を駆動力としてATPを合成する膜酵素(ATP合成酵素)は、生物における最も基本的な酵素として細胞機能を支えている。これらの酵素は、共通の性質からプロトン輸送性ATPaseと総括されている。
本研究では、これらプロトン輸送性ATPaseのうちF_OF_1型ATPaseと液胞型ATPaseに注目し化学反応機構とH^+輸送の共役機構を、分子レベルで明らかにすることを究極の目的として研究を始めた。ATP合成酵素の活性中心は、主に大腸菌のATP合成酵素を研究対象として系統的な変異導入の研究から、βサブユニットのLys-155、Thr-156、Glu-181およびArg-182の残基が触媒中心を形成していることを示した。さらに、同じβサブユニットのGlu-185残基がATP合成酵素の共同性のために必須の残基であることを示した。ATP合成酵素の化学反応とH^+輸送とエネルギー共役において主要な役割を担っているのはγサブユニットであることを示した。γサブユニットのアミノ末端側ヘリックスと、カルボキシル末端側ヘリックスに存在する3つの領域が、エネルギー共役において相互作用していることが明らかになった。
ATP合成酵素のH^+輸送経路はF_Oとよばれ、a、b、cの3種のサブユニットがa1b2c10-12のように複数個づつ集合して作られている。各種の部位に特異的な抗体を作り、これを用いてaサブユニットの構造を解析した。その結果aサブユニットが膜を6回横切っており、アミノ末端とカルボキシル末端がともにF_1側を向いていることを示した。さらに精製したF_Oを、AFM(原子間力顕微鏡)により観察した。その結果、10ケのcサブユニットが集合してリング状の構造を作り、その外側にbサブユニットとaサブユニットが位置しているH^+輸送路のモデルを提出した。
各種の脂溶性カチオンのATP合成酵素、液胞型ATPaseに対する効果を調べた。Chloropromazine、Quinacrine Mustard、およびDequaliniumはいずれもATP合成酵素と液胞型ATPaseの両方を阻害した。バフィロマイシン類似物質であるコンカナマイシンが液胞型ATPaseを阻害すること、この阻害によってMHCclassII分子による抗原の提示が阻害されることを示した。
プロトンポンプの胃壁細胞における特異的転写と細胞内輸送機構の解析
日本学術振興会 科学研究費助成事業
岡 敏彦
1995年 - 1995年
課題番号:07780536
配分額:1000000円 ( 直接経費:1000000円 )
転写因子GATA-GT1またはGATA-GT2と相互作用するタンパク質の検索を目的として、本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。
1、融合タンパク質を用いた因子の検索:GATA-GT1、GATA-GT2と直接的に相互作用するタンパク質を調べるために、HA(ヘマグルチニン)タグを付けたGATA-GT1またはGATA-GT2との融合タンパク質を大腸菌で大量に調製した。そのれら融合タンパク質をプローブとして、胃粘膜組織より調製したcDNAライブラリーの発現系を用いて、相互作用するタンパク質の分離を行なっている。現在までに、2つの陽性クローンを分離できた。さらに、この方法によるクローンの分離を進めるとともに現在得ているクローンについても詳細に解析していく予定である。
2、酵母two-hybrid法を用いた因子の検索:GATA-GT1、GATA-GT2と直接的に相互作用するタンパク質を調べるために、酵母GAL4のDNA結合ドメインとGATA-GT1又はGATA-GT2との融合タンパク質を酵母内で発現させ、それに結合しうる因子をtwo-hybrid法により検索した。現在、胃粘膜組織より調製したcDNAライブラリーの調製が終わり、スクリーニングを開始した。今後、このスクリーニングにより得たクローンをさらに解析してゆき、GATA-GT1、GATA-GT2の転写活性化の機構に関与している因子の役割を明らかにしていく。
ATP合成酵素におけるATP合成(分解)反応とH^+輸送の共役機構
日本学術振興会 科学研究費助成事業
二井 將光, 岡 敏彦, 岩本 昌子, 森山 芳則, 田村 茂彦
1993年 - 1994年
課題番号:05454630
配分額:6400000円 ( 直接経費:6400000円 )
ATP合成酵素は、呼吸鎖の形成するH^+の電気化学的ポテンシャル差を駆動力として、ADPとPi(リン酸)からATPを合成する酵素である。本研究はATP合成酵素による化学反応(ATP合成/分解)とH^+輸送の共役機構を分子レベルで明らかにすることを主な目的とした。
大腸菌のATP合成酵素に注目し、生化学的手法に加えて、本研究では変異の導入とその抑圧変異の分離という遺伝生化学的手法を駆使した。あるアミノ酸置換変異の効果は他のアミノ酸置換によって抑圧された場合、二つのアミノ酸残基が相互作用している可能性が高い。このアプローチを繰り返すことによって、近傍にあるアミノ酸残基を同定することができると考える。得られた主な成果は以下のように要約される。(1)本酵素の活性中心を持つβサブユニットの変異株および各変異を抑圧する変異株を系統的に分離し、活性中心を形成するGlu-181、Arg-182、Lys-155、Thr-156、Ser-174などのアミノ酸残基を明らかにした。(2)H^+輸送路の一部を形成すると考えられるαサブユニットの膜を貫通する部分の変異株と対応する抑圧株を分離し膜貫通部分の構造とH^+輸送路を明らかにした。(3)ATP合成酵素を、通常の大腸菌膜のタンパクの30%まで大量生産する株を構築し、この株を用いH^+輸送路を大量に精製し2次元結晶化の予備実験を終了した。(4)特にβサブユニットに注目し、γサブユニットとの相互作用を解析し、βArg-52がγサブユニットのカルボキシル末端部分を相互作用をしていることを示した。(5)γサブユニット変異によりATP合成/分解とH^+輸送が脱共役している株を解析し、γサブユニットがプロトンゲートとして機能していることを明らかにした。