研究者詳細 - 末次　正幸

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スエツグ　マサユキ

末次　正幸

SUETSUGU Masayuki

*大学が定期的に情報更新している項目（その他は、researchmapの登録情報を転載）

所属*

理学部生命理学科
理学研究科生命理学専攻博士課程後期課程
理学研究科生命理学専攻博士課程前期課程

職名*

教授

学位

博士（薬学）（九州大学）

連絡先

ホームページ

http://www2.rikkyo.ac.jp/web/sue-lab

研究テーマ*

「生命とは何か?」というテーマに対し、バクテリアをはじめとした生きている細胞が自己複製する能力に着目し研究を行っている。「蛍光顕微鏡を用いて、生きている細胞内の分子のふるまいを観測する技術」、「精製蛋白質によりゲノムDNAの複製・組換え・修復・転写翻訳などのシステムを再構成する技術」により、生命が「ふえる」さらには「進化する」仕組みを人工的に再現することを目指している。また、そのアプローチの中で得られた様々な生化学的システムを人工細胞をはじめとする次世代のバイオテクノロジーに実装するための研究も進めている。

研究キーワード

生化学

分子生物学

染色体複製

試験管内再構成

ゲノム合成

合成生物学

担当科目*

2024年度

学内職務経歴*

2020年4月 - 現在

理学部生命理学科教授
2020年4月 - 現在

理学研究科生命理学専攻博士課程前期課程教授
2020年4月 - 現在

理学研究科生命理学専攻博士課程後期課程教授
2013年4月 - 2020年3月

理学部生命理学科准教授
2013年4月 - 2020年3月

理学研究科生命理学専攻博士課程前期課程准教授
2013年4月 - 2020年3月

理学研究科生命理学専攻博士課程後期課程准教授

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外部リンク

研究分野

ライフサイエンス / ゲノム生物学
ライフサイエンス / 分子生物学

経歴

2023年2月 - 現在

Moderna Enzymatics, inc., Director

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2020年4月 - 現在

立教大学理学研究科生命理学専攻博士課程前期課程教授

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2020年4月 - 現在

立教大学理学研究科生命理学専攻博士課程後期課程教授

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2020年4月 - 現在

立教大学理学部生命理学科教授

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2018年12月 - 2023年1月

OriCiro Genomics, inc., Co-ounder CSO

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2013年4月 - 2020年3月

立教大学理学研究科生命理学専攻博士課程前期課程准教授

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2013年4月 - 2020年3月

立教大学理学研究科生命理学専攻博士課程後期課程准教授

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2013年4月 - 2020年3月

立教大学理学部生命理学科准教授

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2011年12月 - 2015年3月

JSTさきがけ研究員

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2011年10月 - 2013年3月

九州大学大学院薬学研究院助教

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2008年4月 - 2011年9月

英国ニューカッスル大学研究員

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2003年1月 - 2008年4月

九州大学大学院薬学研究院助教

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学歴

- 2002年12月

九州大学薬学研究科

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国名：日本国

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受賞

2021年8月

大学発ベンチャー表彰2021 JST理事長賞 OriCiro Genomics

平崎誠司、末次正幸

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2020年10月

バイオインダストリー協会第4回「バイオインダストリー奨励賞」染色体複製サイクル再構成による長鎖環状DNA増幅技術とその応用

末次正幸

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2010年5月

EMBO Conference on Replication/repair and segregation of chromosome EMBO poster prize

Su’etsugu, M, Errington, J

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受賞区分：国際学会・会議・シンポジウム等の賞

受賞国：ドイツ連邦共和国

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論文

Self-growing protocell models in aqueous two-phase system induced by internal DNA replication reaction

Yoshihiro Minagawa, Moe Yabuta, Masayuki Su’etsugu, Hiroyuki Noji

2024年7月2日

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DOI： 10.1101/2024.07.01.599542

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Design of an Artificial Peptide Inspired by Transmembrane Mitochondrial Protein for Escorting Exogenous DNA into the Mitochondria to Restore their Functions by Simultaneous Multiple Gene Expression

Naoto Yoshinaga, Takaaki Miyamoto, Masaki Odahara, Noriko Takeda‐Kamiya, Kiminori Toyooka, Seia Nara, Haruna Nishimura, Feng Ling, Masayuki Su'etsugu, Minoru Yoshida, Keiji Numata

Advanced Functional Materials 2023年11月

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掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：Wiley

Abstract

Mitochondria are vital organelles regulating essential cellular functions. Human mitochondrial DNA (mtDNA) consists of 37 genes, 13 of which encode mitochondrial proteins, and the remaining 24 genes encode two ribosomal RNAs and 22 transfer RNAs needed for the translation of the mtDNA‐encoded 13 proteins. However, mtDNA often impairs the expression and function of these genes due to various mutations, ultimately causing mitochondrial dysfunction. To recover from this desperate condition, developing the technology to supply all mitochondrial proteins encoded by mtDNA at once is an urgent task, but there is no established strategy for this purpose. In this study, a simple yet effective mitochondrial gene delivery system is proposed comprising an artificial peptide inspired by a transmembrane mitochondrial membrane protein. The designed mitochondria‐targeting peptides presented on the carrier surface effectively guide the encapsulated plasmid to the mitochondria, facilitating mitochondrial uptake and gene expression. The developed system successfully delivers exogenous mtDNA to mtDNA‐depleted cells and leads to simultaneous multigene expression, ultimately restoring mitochondrial functions, including the mitochondrial respiration rate. The established multiple gene expression system in each mitochondrion is a game‐changing technology that can accelerate the development of mitochondrial engineering technologies as well as clinical applications for mitochondrial diseases.

DOI： 10.1002/adfm.202306070

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Enzymatic Supercoiling of Bacterial Chromosomes Facilitates Genome Manipulation

Hironobu Fujita, Ayane Osaku, Yuto Sakane, Koki Yoshida, Kayoko Yamada, Seia Nara, Takahito Mukai, Masayuki Su’etsugu

ACS Synthetic Biology 2022年8月23日

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掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：American Chemical Society (ACS)

DOI： 10.1021/acssynbio.2c00353

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In Vitro Amplification of Whole Large Plasmids Via Transposon-Mediated oriC Insertion

Seia Nara, Masayuki Su'etsugu

BioTechniques71 ( 4 ) 528 - 533 2021年10月

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掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：Future Science Ltd

DOI： 10.2144/btn-2021-0068

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Amplification of over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets. 国際誌

Hiroshi Ueno, Hiroki Sawada, Naoki Soga, Mio Sano, Seia Nara, Kazuhito V Tabata, Masayuki Su'etsugu, Hiroyuki Noji

ACS synthetic biology10 ( 9 ) 2179 - 2186 2021年9月17日

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

Reconstitution of the DNA amplification system in microcompartments is the primary step toward artificial cell construction through a bottom-up approach. However, amplification of >100 kbp DNA in micrometer-sized reactors has not yet been achieved. Here, implementing a fully reconstituted replisome of Escherichia coli in micrometer-sized water-in-oil droplets, we developed the in-droplet replication cycle reaction (RCR) system. For a 16 kbp template DNA, the in-droplet RCR system yielded positive RCR signals with a high success rate (82%) for the amplification from single molecule template DNA. The success rate for a 208 kbp template DNA was evidently lower (23%). This study establishes a platform for genome-sized DNA amplification from a single copy of template DNA with the potential to build more complex artificial cell systems comprising a large number of genes.

DOI： 10.1021/acssynbio.0c00584

PubMed

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Grand scale genome manipulation via chromosome swapping in Escherichia coli programmed by three one megabase chromosomes. 国際誌

Tatsuya Yoneji, Hironobu Fujita, Takahito Mukai, Masayuki Su'etsugu

Nucleic acids research (Breakthrough paper selected)49 ( 15 ) 8407 - 8418 2021年4月28日

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：Oxford University Press ({OUP})

In bacterial synthetic biology, whole genome transplantation has been achieved only in mycoplasmas that contain a small genome and are competent for foreign genome uptake. In this study, we developed Escherichia coli strains programmed by three 1-megabase (Mb) chromosomes by splitting the 3-Mb chromosome of a genome-reduced strain. The first split-chromosome retains the original replication origin (oriC) and partitioning (par) system. The second one has an oriC and the par locus from the F plasmid, while the third one has the ori and par locus of the Vibrio tubiashii secondary chromosome. The tripartite-genome cells maintained the rod-shaped form and grew only twice as slowly as their parent, allowing their further genetic engineering. A proportion of these 1-Mb chromosomes were purified as covalently closed supercoiled molecules with a conventional alkaline lysis method and anion exchange columns. Furthermore, the second and third chromosomes could be individually electroporated into competent cells. In contrast, the first split-chromosome was not able to coexist with another chromosome carrying the same origin region. However, it was exchangeable via conjugation between tripartite-genome strains by using different selection markers. We believe that this E. coli-based technology has the potential to greatly accelerate synthetic biology and synthetic genomics.

DOI： 10.1093/nar/gkab298

PubMed

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Overcoming the Challenges of Megabase-Sized Plasmid Construction in Escherichia coli. 国際誌

Takahito Mukai, Tatsuya Yoneji, Kayoko Yamada, Hironobu Fujita, Seia Nara, Masayuki Su'etsugu

ACS synthetic biology9 ( 6 ) 1315 - 1327 2020年6月19日

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

Although Escherichia coli has been a popular tool for plasmid construction, this bacterium was believed to be "unsuitable" for constructing a large plasmid whose size exceeds 500 kilobases. We assumed that traditional plasmid vectors may lack some regulatory DNA elements required for the stable replication and segregation of such a large plasmid. In addition, the use of a few site-specific recombination systems may facilitate cloning of large DNA segments. Here we show two strategies for constructing 1-megabase (1-Mb) secondary chromosomes by using new bacterial artificial chromosome (BAC) vectors. First, the 3-Mb genome of a genome-reduced E. coli strain was split into two chromosomes (2-Mb and 1-Mb), of which the smaller one has the origin of replication and the partitioning locus of the Vibrio tubiashii secondary chromosome. This chromosome fission method (Flp-POP cloning) works via flippase-mediated excision, which coincides with the reassembly of a split chloramphenicol resistance gene, allowing chloramphenicol selection. Next, we developed a new cloning method (oriT-POP cloning) and a fully equipped BAC vector (pMegaBAC1H) for developing a 1-Mb plasmid. Two 0.5-Mb genomic regions were sequentially transferred from two donor strains to a recipient strain via conjugation and captured by pMegaBAC1H in the recipient strain to produce a 1-Mb plasmid. This 1-Mb plasmid was transmissible to another E. coli strain via conjugation. Furthermore, these 1-Mb secondary chromosomes were amplifiable in vitro by using the reconstituted E. coli chromosome replication cycle reaction (RCR). These strategies and technologies would make popular E. coli cells a productive factory for designer chromosome engineering.

DOI： 10.1021/acssynbio.0c00008

PubMed

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Cell-Penetrating Peptide-Mediated Transformation of Large Plasmid DNA into Escherichia coli 査読有り

Islam M.M., Odahara M., Yoshizumi T., Oikawa K., Kimura M., Su'etsugu, M. and Numata K.

ACS Synth. Biol.8 ( 5 ) 1215 - 1218 2019年4月

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掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1021/acssynbio.9b00055

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Efficient Arrangement of the Replication Fork Trap for In Vitro Propagation of Monomeric Circular DNA in the Chromosome-Replication Cycle Reaction.

Hasebe T, Narita K, Hidaka S, Su'etsugu M

Life (Basel, Switzerland) 2018年9月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.3390/life8040043

PubMed

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Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors.

Takemoto N, Numata I, Su'etsugu M, Miyoshi-Akiyama T

Nucleic acids research 2018年7月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1093/nar/gky481

PubMed

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Essentiality of walRK for growth in bacillus subtilis and its role during heat stress

Hiraku Takada, Yuh Shiwa, Yuta Takino, Natsuki Osaka, Shuhei Ueda, Satoru Watanabe, Taku Chibazakura, Masayuki Su’Etsugu, Ryutaro Utsumi, Hirofumi Yoshikawa

Microbiology (United Kingdom)164 ( 4 ) 670 - 684 2018年4月1日

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：Microbiology Society

WalRK is an essential two-component signal transduction system that plays a central role in coordinating cell wall synthesis and cell growth in Bacillus subtilis. However, the physiological role of WalRK and its essentiality for growth have not been elucidated. We investigated the behaviour of WalRK during heat stress and its essentiality for cell proliferation. We determined that the inactivation of the walHI genes which encode the negative modulator of WalK, resulted in growth defects and eventual cell lysis at high temperatures. Screening of suppressor mutations revealed that the inactivation of LytE, an dl-endopeptidase, restored the growth of the ΔwalHI mutant at high temperatures. Suppressor mutations that reduced heat induction arising from the walRK regulon were also mapped to the walK ORF. Therefore, we hypothesized that overactivation of LytE affects the phenotype of the ΔwalHI mutant. This hypothesis was corroborated by the overexpression of the negative regulator of LytE, IseA and PdaC, which rescued the growth of the ΔwalHI mutant at high temperatures. Elucidating the cause of the temperature sensitivity of the ΔwalHI mutant could explain the essentiality of WalRK. We proved that the constitutive expression of lytE or cwlO using a synthetic promoter uncouples these expressions from WalRK, and renders WalRK nonessential in the pdaC and iseA mutant backgrounds. We propose that the essentiality of WalRK is derived from the coordination of cell wall metabolism with cell growth by regulating dl-endopeptidase activity under various growth conditions.

DOI： 10.1099/mic.0.000625

Scopus

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Exponential propagation of large circular DNA by reconstitution of a chromosome-replication cycle.

Su'etsugu M, Takada H, Katayama T, Tsujimoto H

Nucleic acids research 2017年11月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1093/nar/gkx822

PubMed

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Overall Shapes of the SMC-ScpAB Complex Are Determined by Balance between Constraint and Relaxation of Its Structural Parts

Katsuhiko Kamada, Masayuki Su'etsugu, Hiraku Takada, Makoto Miyata, Tatsuya Hirano

STRUCTURE25 ( 4 ) 603 - + 2017年4月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：CELL PRESS

The SMC-ScpAB complex plays a crucial role in chromosome organization and segregation in many bacteria. It is composed of a V-shaped SMC dimer and an ScpAB subcomplex that bridges the two Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) head domains. Despite its functional significance, the mechanistic details of SMC-ScpAB remain obscure. Here we provide evidence that ATP-dependent head-head engagement induces a lever movement of the SMC neck region, which might help to separate juxtaposed coiled-coil arms. Binding of the ScpA N-terminal domain (NTD) to the SMC neck region is negatively regulated by the ScpB C-terminal domain. Mutations in the ScpA NTD compromise this regulation and profoundly affect the overall shape of the complex. The SMC hinge domain is structurally relaxed when free from coiled-coil juxtaposition. Taken together, we propose that the structural parts of SMC-ScpAB are subjected to the balance between constraint and relaxation, cooperating to modulate dynamic conformational changes of the whole complex.

DOI： 10.1016/j.str.2017.02.008

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The DnaA N-terminal domain interacts with Hda to facilitate replicase clamp-mediated inactivation of DnaA. 査読有り

Su'etsugu M, Harada Y, Keyamura K, Matsunaga C, Kasho K, Abe Y, Ueda T, Katayama T

Environmental microbiology 2013年5月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1111/1462-2920.12147

PubMed

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The Replicase Sliding Clamp Dynamically Accumulates behind Progressing Replication Forks in Bacillus subtilis Cells 査読有り

Masayuki Su'etsugu, Jeff Errington

MOLECULAR CELL41 ( 6 ) 720 - 732 2011年3月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：CELL PRESS

The sliding clamp is an essential component of the replisome required for processivity of DNA synthesis and several other aspects of chromosome metabolism. However, the in vivo dynamics of the clamp are poorly understood. We have used various biochemical and cell biological methods to study the dynamics of clamp association with the replisome in Bacillus subtilis cells. We find that clamps form large assemblies on DNA, called "clamp zones." Loading depends on DnaG primase and is probably driven by Okazaki fragment initiation on the lagging strand. Unloading, which is probably regulated, only occurs after many clamps have accumulated on the DNA. On/off cycling allows chromosomal zones of about 200 accumulated clamps to follow the replisome. Since we also show that clamp zones recruit proteins bearing a clamp-binding sequence to replication foci, the results highlight the clamp as a central organizer in the structure and function of replication foci.

DOI： 10.1016/j.molcel.2011.02.024

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Hda monomerization by ADP binding promotes replicase clamp-mediated DnaA-ATP hydrolysis. 査読有り

Su'etsugu M, Nakamura K, Keyamura K, Kudo Y, Katayama T

The Journal of biological chemistry 2008年10月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1074/jbc.m803158200

PubMed

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Modes of overinitiation, dnaA gene expression, and inhibition of cell division in a novel cold-sensitive hda mutant of Escherichia coli. 査読有り

Fujimitsu K, Su'etsugu M, Yamaguchi Y, Mazda K, Fu N, Kawakami H, Katayama T

Journal of bacteriology 2008年5月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1128/jb.00044-08

PubMed

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The interaction of DiaA and DnaA regulates the replication cycle in E. coli by directly promoting ATP-DnaA-specific initiation complexes 査読有り

Kenji Keyamura, Norie Fujikawa, Takuma Ishida, Shogo Ozaki, Masayuki Su'etsugu, Kazuyuki Fujimitsu, Wataru Kagawa, Shigeyuki Yokoyama, Hitoshi Kurumizaka, Tsutomu Katayama

GENES & DEVELOPMENT21 ( 16 ) 2083 - 2099 2007年8月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：COLD SPRING HARBOR LAB PRESS, PUBLICATIONS DEPT

Escherichia coli DiaA is a DnaA-binding protein that is required for the timely initiation of chromosomal replication during the cell cycle. In this study, we determined the crystal structure of DiaA at 1.8 angstrom resolution. DiaA forms a homotetramer consisting of a symmetrical pair of homodimers. Mutational analysis revealed that the DnaA-binding activity and formation of homotetramers are required for the stimulation of initiation by DiaA. DiaA tetramers can bind multiple DnaA molecules simultaneously. DiaA stimulated the assembly of multiple DnaA molecules on oriC, conformational changes in ATP-DnaA-specific initiation complexes, and unwinding of oriC duplex DNA. The mutant DiaA proteins are defective in these stimulations. DiaA associated also with ADP-DnaA, and stimulated the assembly of inactive ADP-DnaA oriC complexes. Specific residues in the putative phosphosugar-binding motif of DiaA were required for the stimulation of initiation and formation of ATP-DnaA-specific-oriC complexes. Our data indicate that DiaA regulates initiation by a novel mechanism, in which DiaA tetramers most likely bind to multiple DnaA molecules and stimulate the assembly of specific ATP-DnaA-oriC complexes. These results suggest an essential role for DiaA in the promotion of replication initiation in a cell cycle coordinated manner.

DOI： 10.1101/gad.1561207

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The exceptionally tight affinity of DnaA for ATP/ADP requires a unique aspartic acid residue in the AAA+ sensor 1 motif. 査読有り

Kawakami H, Ozaki S, Suzuki S, Nakamura K, Senriuchi T, Su'etsugu M, Fujimitsu K, Katayama T

Molecular microbiology 2006年10月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1111/j.1365-2958.2006.05450.x

PubMed

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An isolated Hda–clamp complex is functional in the regulatory inactivation of DnaA and DNA replication 査読有り

Kawakami, H, Su'etsugu, M, Katayama, T

J. Struct. Biol.156 220 - 229 2006年8月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

CiNii Article

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Involvement of the Escherichia coli folate-binding protein YgfZ in RNA modification and regulation of chromosomal replication initiation (vol 59, pg 265, 2005) 査読有り

T Ote, M Hashimoto, Y Ikeuchi, M Su'etsugu, T Suzuki, T Katayama, JI Kato

MOLECULAR MICROBIOLOGY60 ( 1 ) 252 - 252 2006年4月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：BLACKWELL PUBLISHING

The Escherichia coli hda gene codes for a DnaA-related protein that is essential for the regulatory inactivation of DnaA (RIDA), a system that controls the initiation of chromosomal replication. We have identified the ygfZ gene, which encodes a folate-binding protein, as a suppressor of hda mutations. The ygfZ null mutation suppresses an hda null mutation. The over-initiation and abortive elongation phenotypes conferred by the hda mutations are partially suppressed in an hda ygfZ background. The accumulation of the active form of DnaA, ATP-DnaA, in the hda mutant is suppressed by the disruption of the ygfZ gene, indicating that YgfZ is involved in regulating the level of ATP-DnaA. Although ygfZ is not an essential gene, the ygfZ disruptant grows slowly, especially at low temperature, demonstrating that this gene is important for cellular proliferation. We have identified mnmE (trmE) as a suppressor of the ygfZ disruption. This gene encodes a GTPase involved in tRNA modification. Examination of RNA modification in the ygfZ mutant reveals reduced levels of 2-methylthio N-6-isopentenyladenosine, indicating that YgfZ participates in the methylthio-group formation of this modified nucleoside in some tRNAs. These results suggest that YgfZ is a key factor in regulatory networks that act via tRNA modification.

DOI： 10.1111/j.1365-2958.2006.05067.x

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Involvement of the Escherichia coli folate-binding protein YgfZ in RNA modification and regulation of chromosomal replication initiation 査読有り

T Ote, M Hashimoto, Y Ikeuchi, M Su'etsugu, T Suzuki, T Katayama, J Kato

MOLECULAR MICROBIOLOGY59 ( 1 ) 265 - 275 2006年1月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：BLACKWELL PUBLISHING

The Escherichia coli hda gene codes for a DnaA-related protein that is essential for the regulatory inactivation of DnaA (RIDA), a system that controls the initiation of chromosomal replication. We have identified the ygfZ gene, which encodes a folate-binding protein, as a suppressor of hda mutations. The ygfZ null mutation suppresses an hda null mutation. The over-initiation and abortive elongation phenotypes conferred by the hda mutations are partially suppressed in an hda ygfZ background. The accumulation of the active form of DnaA, ATP-DnaA, in the hda mutant is suppressed by the disruption of the ygfZ gene, indicating that YgfZ is involved in regulating the level of ATP-DnaA. Although ygfZ is not an essential gene, the ygfZ disruptant grows slowly, especially at low temperature, demonstrating that this gene is important for cellular proliferation. We have identified mnmE (trmE) as a suppressor of the ygfZ disruption. This gene encodes a GTPase involved in tRNA modification. Examination of RNA modification in the ygfZ mutant reveals reduced levels of 2-methylthio-6-iodeadenosine, indicating that YgfZ participates in the methylthio-group formation of this modified nucleoside in some tRNAs. These results suggest that YgfZ is a key factor in regulatory networks that act via tRNA modification.

DOI： 10.1111/j.1365-2958.2005.04932.x

PubMed

CiNii Article

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Reconstitution of in vitro inactivation and reactivation systems of DnaA protein for the control of chromosomal replication initiation in Escherichia coli

Masayuki Su'etsugu, Kazuyuki Fujimitsu, Tsutomu Katayama

2006 IEEE INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON MICRO-NANOMECHATRONICS AND HUMAN SCIENCE 334 - + 2006年

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（国際会議プロシーディングス）出版者・発行元：IEEE

The Escherichia coli initiator protein, DnaA binds to the replicational origin of the chromosome (oriC) and initiates the replication in a manner depending on ATP ' binding. Replication of mini-chromosome (a plasmid bearing oriC) has been reconstituted in vitro using crude extracts or purified proteins. In these in vitro systems, only ATP-bound form of DnaA is active to initiate a series of initiation reactions which leads to loading of the DNA polymerase III holoenzyme (pol III HE) onto DNA for DNA synthesis. In a manner dependent on Hda protein and DNA loading of pol III HE, ATP bound on DnaA is hydrolyzed. The resultant ADP-bound form of DnaA is inactive for the initiation. This inactivation system called RIDA (regulatory inactivation of DnaA) ensures the replication initiation only once per cell cycle. We here describe recent progress on our system to reconstitute the inactivation of DnaA by RIDA and a novel system to regenerate active DnaA. The reconstitution of the Hda-dependent DnaA-ATP hydrolysis requires the DNA-loaded form of the sliding clamp. This complex is formed by loading of the beta subunit of pol III HE onto DNA during replication process. Hda protein forms a stable complex with the sliding clamp, and most likely has a direct contact to ATP bound on DnaA. The cellular ATP-DnaA level fluctuates during the cell cycle. Regeneration from ADP-DnaA to ATP-DnaA is observed in vivo before the next round of the replication. Recently we have found a specific DNA segment DARS (DnaA-reactivating sequences) that has an activity to release ADP bound on DnaA. ATP-DnaA is regenerated by nucleotide-exchange in the presence of DARS and the elevated concentrations of ATP. The resultant ATP-DnaA was active in the mini-chromosome replication reaction in vitro. Thus, DARS can functionally reactivate ADP-DnaA. The inactivation-reactivation cycle of DnaA might be reconstituted in vitro in a manner controled by RIDA and DARS.

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Protein Associations in DnaA-ATP Hydrolysis Mediated by the Replicase Clamp-Hda Complex 査読有り

Su'etsugu, M, Shimuta, T, Ishida, T, Kawakami, H, Katayama, T

J. Biol. Chem.280 6528 - 6536 2005年8月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

CiNii Article

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Molecular mechanism of DNA replication-coupled inactivation of the initiator protein in Escherichia coli: Interaction of DnaA with the sliding clamp-loaded DNA and the sliding clamp-Hda complex 査読有り

Su'etsugu, M, Takata, M, Kubota, T, Matsuda, Y, Katayama, T

Genes Cells9 509 - 522 2004年8月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

CiNii Article

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Transcriptional control for initiation of chromosomal replication in Escherichia coli: fluctuation of the level of origin transcription ensures timely initiation. 査読有り

Su'etsugu M, Emoto A, Fujimitsu K, Keyamura K, Katayama T

Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 2003年9月

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DOI： 10.1046/j.1365-2443.2003.00671.x

PubMed

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Determination of the secondary structure in solution of the Escherichia coli DnaA DNA-binding domain 査読有り

Takayuki Obita, Takafumi Iwura, Masayuki Su'etsugu, Yoichiro Yoshida, Yoshitsugu Tanaka, Tsutomu Katayama, Tadashi Ueda, Taiji Imoto

Biochemical and Biophysical Research Communications299 ( 1 ) 42 - 48 2002年

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

DnaA protein binds specifically to a group of binding sites collectively called as DnaA boxes within the bacterial replication origin to induce local unwinding of duplex DNA. The DNA-binding domain of DnaA, domain IV, comprises the C-terminal 94 amino acid residues of the protein. We overproduced and purified a protein containing only this domain plus a methionine residue. This protein was stable as a monomer and maintained DnaA box-specific binding activity. We then analyzed its solution structure by CD spectrum and heteronuclear multi-dimensional NMR experiments. We established extensive assignments of the 1H, 13C, and 15N nuclei, and revealed by obtaining combined analyses of chemical shift index and NOE connectivities that DnaA domain IV contains six α-helices and no β-sheets, consistent with results of CD analysis. Mutations known to reduce DnaA box-binding activity were specifically located in or near two of the α-helices. These findings indicate that the DNA-binding fold of DnaA domain IV is unique among origin-binding proteins. © 2002 Elsevier Science (USA). All rights reserved.

DOI： 10.1016/S0006-291X(02)02590-1

Scopus

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DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro: A role for DnaA arginine-334 of the AAA+ Box VIII motif in ATP hydrolysis 査読有り

Masayuki Su'Etsugu, Hironori Kawakami, Kenji Kurokawa, Toshio Kubota, Makoto Takata, Tsutomu Katayama

Molecular Microbiology40 ( 2 ) 376 - 386 2001年

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記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

The DnaA protein, which initiates chromosomal replication in Escherichia coli, is negatively regulated by both the sliding clamp of DNA polymerase III holoenzyme and the IdaB protein. We have found that, when the amount of minichromosome is limited in an in vitro replication system, minichromosomal replication-stimulated hydrolysis of DnaA-bound ATP yields the ADP-bound inactive form. The number of sliding clamps formed during replication was at least five per minichromosome, which is 2.7-fold higher than the number formed during incubation without replication. These results support the notion that coupling of DnaA-ATP hydrolysis to DNA replication is the outcome of enhanced clamp formation. We have also found that the amino acid substitution R334H in DnaA severely inhibits the hydrolysis of bound ATP in vitro. Whereas ATP bound to wild-type DnaA is hydrolysed in a DNA-dependent intrinsic manner or in a sliding clamp-dependent manner, ATP bound to DnaA R334H protein was resistant to hydrolysis under the same conditions. This arginine residue may be located in the vicinity where ATP binds, and therefore may play an essential role in ATP hydrolysis. This residue is highly conserved among DnaA homologues and also in the Box VIII motif of the AAA+ protein family.

DOI： 10.1046/j.1365-2958.2001.02378.x

Scopus

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MISC

なぜ今，長鎖DNA合成なのか招待有り

末次正幸

実験医学（羊土社）41 ( 3 ) 2023年1月

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DNAの新常識 8.長鎖DNA合成技術と合成細胞-人工デザインされたゲノムの合成と評価にむけて

末次正幸

実験医学40 ( 12 ) 2022年

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J-GLOBAL

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OriCiro Genomicsのセルフリー長鎖環状DNA合成技術

末次正幸

ファルマシア（日本薬学会）57 ( 3 ) 218 - 220 2021年3月

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メガサイズ染色体のバクテリア細胞への出し入れおよび増幅の技術

末次正幸

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)44th 2021年

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J-GLOBAL

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ゲノム合成時代のセルフリーDNAクローニング

末次正幸

バイオサイエンスとインダストリー78 ( 6 ) 550 - 551 2020年11月

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大腸菌染色体複製サイクルの試験管内再構成と合成生物学

末次正幸

「生物物理」誌60 ( 5 ) 284 - 287 2020年10月

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クローズアップ実験法(series 321) 大腸菌いらずのセルフリー長鎖DNAクローニング招待有り

奈良聖亜, 末次正幸

実験医学38 ( 6 ) 1023 - 1028 2020年4月

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担当区分：最終著者,　責任著者記述言語：日本語出版者・発行元：(株)羊土社

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大腸菌染色体複製サイクル再構成系を基盤とした自己複製システムの構築

奈良聖亜, 長谷部友憲, 高田啓, 末次正幸

日本ゲノム微生物学会年会要旨集14th 2020年

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J-GLOBAL

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大腸菌ゲノム複製サイクル再構成系とその自己複製

末次正幸, 長谷部友憲, 高田啓

日本遺伝学会大会プログラム・予稿集91st 2019年

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J-GLOBAL

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染色体複製サイクルの自律的な繰り返しによるDNA増幅反応

末次正幸

化学と生物 2019年1月

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記述言語：日本語掲載種別：記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

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細胞を使わないゲノム合成技術

末次正幸

月刊バイオインダストリー 8月号 2018年8月

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記述言語：日本語掲載種別：記事・総説・解説・論説等（商業誌、新聞、ウェブメディア）

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ゲノム合成技術、特集「生命をつくる」

末次正幸

現代化学1月号 2018年1月

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記述言語：日本語掲載種別：記事・総説・解説・論説等（商業誌、新聞、ウェブメディア）

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ゲノム複製サイクル再構成系を利用した新規DNA増幅技術

末次正幸, 加納巧希, 倉田竜明, 篠原赳, 高田啓

日本生化学会大会(Web)90th 2017年

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J-GLOBAL

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バクテリアSMC複合体のリング開閉機構

鎌田勝彦, 末次正幸, 高田啓, 宮田真人, 平野達也

日本ゲノム微生物学会年会要旨集11th 2017年

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J-GLOBAL

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ゲノム複製サイクル試験管内再構成系における変異誘発と分子進化

末次正幸, 徳永翼, 高田啓, 辻本寛子

日本進化学会大会プログラム・講演要旨集(Web)18th 2016年

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J-GLOBAL

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大腸菌染色体複製サイクルと転写翻訳反応との統合再構成

末次正幸, 辻本寛子, 高田啓

日本生化学会大会(Web)89th 2016年

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J-GLOBAL

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大腸菌ミニ染色体複製サイクルと転写・翻訳反応の再構成の試み

高田啓, 辻本寛子, 末次正幸

日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)2016 2016年

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J-GLOBAL

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枯草菌二成分制御系Wa1RKの生育必須性の解析

高田啓, 高田啓, 植田修平, 志波優, 志波優, 渡辺智, 千葉櫻拓, 末次正幸, 内海龍太郎, 吉川博文

日本農芸化学会関東支部講演要旨集2016 ( Oct ) 2016年

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大腸菌の増殖に必須な長鎖逆方向反復配列ELIXIR1の機能解析

土田愛海, 川上広宣, 加生和寿, 末次正幸, 末次正幸, 片山勉

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)37th 2014年

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Characterization of the E. coli mini-chromosome replication reactions reconstituted with the crude system and the purified system

Masayuki Su'etsugu, Tsutomu Katayama

GENES & GENETIC SYSTEMS87 ( 6 ) 390 - 390 2012年12月

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記述言語：英語掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（国際会議）出版者・発行元：GENETICS SOC JAPAN

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DNA複製装置スライディングクランプの枯草菌の細胞内における動的な集合

末次正幸

新着論文レビュー 2011年4月

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記述言語：日本語掲載種別：記事・総説・解説・論説等（その他）出版者・発行元：FIRST AUTHOR’S

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Regulatory mechanism for replicational initiation by DiaA, a DnaA-binding factor

Tsutomu Katayama, Kenji Keyamura, Norie Fujikawa, Takuma Ishida, Shogo Ozaki, Masayuki Suetsugu, Kazuyuki Fujimitsu, Wataru Kagawa, Shigeyuki Yokoyama, Hitoshi Kurumizaka

GENES & GENETIC SYSTEMS82 ( 6 ) 508 - 508 2007年12月

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記述言語：英語掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（国際会議）出版者・発行元：GENETICS SOC JAPAN

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Functional replacement of the AAA+ sensor 1 motif in DnaA, the initiator of chromosomal replication in E-coli

Shogo Ozaki, Hironori Kawakami, Shigeo Suzuki, Kenta Nakamura, Takayuki Senriuchi, Masayuki Su'etsugu, Kazuyuki Fujimitsu, Tsutomu Katayama

GENES & GENETIC SYSTEMS81 ( 6 ) 407 - 407 2006年12月

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記述言語：英語掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（国際会議）出版者・発行元：GENETICS SOC JAPAN

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書籍等出版物

ゲノム複製サイクル再構成系とその展望、「人工細胞の創製とその応用」（植田充美監修）、シーエムシー出版、172-180頁

末次正幸（担当：単著）

シーエムシー出版 2017年1月31日

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記述言語：日本語著書種別：学術書

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Chromosome replication of E.coli and B.subtilis. Escherichia coli and Bacillus subtilis; the frontiers of molecular microbiology revisited

Katayama, T, Su'etsugu, M（担当：共著）

Research Signpost 2012年8月

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記述言語：英語著書種別：教科書・概説・概論

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「大腸菌ゲノムDNA複製系」、『ゲノミクス・プロテオミクスの新展開−生物情報の解析と応用−』（今中忠行監修）

片山勉, 末次正幸, 川上広宣（担当：共著）

エヌ・ティー・エス 2004年8月

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記述言語：日本語著書種別：学術書

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「大腸菌ゲノムDNA複製系」、『ゲノミクス・プロテオミクスの新展開?生物情報の解析と応用?』（今中忠行監修）

片山勉, 末次正幸, 川上広宣（担当：共著）

エヌ・ティー・エス 2004年8月

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記述言語：日本語著書種別：学術書

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講演・口頭発表等

大腸菌自己複製システムの人工合成に向けたアプローチ

末次正幸

2023年度国立遺伝学研究所研究会、三島 2024年3月28日

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大腸菌DNA複製の基礎研究からの合成生物学的Exit

末次正幸

第23回大隅基礎科学創成財団微生物コンソーシアム、オンライン 2024年2月2日

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細胞をつくるボトムアップとトップダウンのアプローチ

末次正幸

第6回ExCELLSシンポジウム、自然科学研究機構岡崎 2024年1月22日

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生命はつくれるか、ボトムアップとトップタウンの合成生物学的アプローチ

末次正幸

大隅ライフサイエンス研究会第10回シンポジウム、東工大 2023年12月20日

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Cell-free Genome Synthesis Technology for Drug Discovery and Development

末次正幸

第97回日本薬理学会年会（シンポジウム）、神戸 2023年12月15日

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RCR-based plasmid synthesis utilizing an oligo pool

Satoru Sumi, Hayato Ishitobi, Takuya Koyama, Masayuki Su’etsugu

ASBA2023, Awaji 2023年12月13日

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Engineering of oriC via adaptive evolution in the reconstituted E. coli replication-cycle reaction (RCR)

Shota Suzuki, Masayuki Su’etsugu

ASBA2023, Awaji 2023年12月13日

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Toward a construction of self-replicating system driven by transcription and translation of replication genes

Yuta Yamagishi, Naoki Sonoyama, Naoki Kawakami, Tomonori Hasebe, Masayuki Su’etsugu

ASBA2023, Awaji 2023年12月13日

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n vitro evolutionary engineering using the reconstituted E. coli replication-cycle reaction

Kenta Ichinoe, Masayuki Su’etsugu

ASBA2023, Awaji 2023年12月13日

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n vitro Genome Propagation Towards Cell Synthesis

Masayuki Su’etsugu

ASBA2023, Awaji 2023年12月13日

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複製遺伝⼦群の転写翻訳で駆動する環状DNA⾃⼰複製系の構築に向けた検討

山岸勇太, 園山能基, 川上直貴, 谷部友憲, 末次正幸

第46回日本分子生物学会年会（ポスター）、神戸 2023年12月6日

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Replication Cycle Reaction and Beyond

末次正幸

第46回日本分子生物学会年会(シンポジウム)@オンライン 2023年12月1日

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基礎研究からのオリシロ社創業、M&Aイグジットまでの4年間招待有り

末次正幸

⼈と知と物質で未来を創るクロスオーバーアライアンス 2023年11月30日

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Adaptive evolution of oriC through in vitro propagation in RCR

Shota Suzuki, Masayuki Su’etsugu

BACELL2023, Kobe 2023年11月21日

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A journey of OriCiro Genomics from academia research to M&A exit 招待有り

末次正幸

第61回日本生物物理学会年会(シンポジウム)@名古屋 2023年11月14日

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オリゴプールを用いたセルフリープラスミド合成

角悟, 石飛隼人, 小山拓也, 末次正幸

「細胞を創る」研究会 16.0（ポスター）、駒場 2023年9月25日

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複製遺伝子群の転写翻訳で駆動する環状DNA自己複製系

山岸勇太, 園山能基, 川上直貴, 谷部友憲, 末次正幸

「細胞を創る」研究会 16.0（ポスター）、駒場 2023年9月25日

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Reconstituted Replication Cycle System of Escherichia coli Genome for Cell Synthesis 招待有り

Masayuki Su'etsugu

Korea-Japan Bottom-up Synthetic Biology Workshop @ELSI 2023年9月6日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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ｍRNA 医薬に貢献するセルフリー長鎖DNA合成技術招待有り

末次正幸

第14回日本RNAi研究会 @広島 2023年9月1日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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染色体複製サイクル再構成系の技術展開

末次正幸

理研シンポジウム：Synthetic Biology -生物学の新たな潮流- 2023年8月2日

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Rapid production of plasmid DNA without relying on Escherichia coli 招待有り

Masayuki Su’etsugu

日本核酸医薬学会第8回年会 @名古屋大学 2023年7月11日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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OriCiro History 招待有り

末次正幸

日本ベンチャーキャピタル協会(JVCA) 産学連携ウェビナー 2023年7月5日

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RCR と PUREsystem を利用した自己複製系の構築に向けた検討

園山能基, 山岸勇太, 奈良聖亜, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（ポスター）、鶴岡 2023年6月29日

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環状 DNA 増幅系 RCR を利用した塩基配列エラーの除去技術

石飛隼人, 小山拓也, 角悟, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（ポスター）、鶴岡 2023年6月29日

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複製遺伝子群の転写翻訳で駆動する環状DNA自己複製系

山岸勇太, 川上直貴, 谷部友憲, 高田啓, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（ポスター）、鶴岡 2023年6月29日

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R1 plasmid複製開始にみられるCIS機構の分子メカニズム解明に向けた解析

一戸謙太, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（ポスター）、鶴岡 2023年6月29日

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oriC改変による大腸菌複製サイクル再構成反応の促進効果

鈴木祥太, 宮内翼, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（ポスター）、鶴岡 2023年6月29日

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大腸菌染色体複製サイクル再構成系RCRへの制御機構の組み込みと、そのリアルタイム解析

加納巧希, 末次正幸

第19回21世紀大腸菌研究会（口頭）、鶴岡 2023年6月29日

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セルフリー長鎖DNA合成技術の先端医薬への実装招待有り

末次正幸

東大駒場リサーチキャンパス公開シンポジウム「ｍRNA医薬を知る」 2023年6月9日

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スタートアップ起業からモデルナへ売却までのディープな4年間招待有り

末次正幸

東京薬科大学セミナー 2023年5月8日

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セルフリーDNA合成技術のディープな話招待有り

末次正幸

京都産業大学SPRING講演会 2023年4月20日

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染色体複製サイクル再構成系と長鎖DNA合成招待有り

末次正幸

第4回 mRNA薬検討会 2023年4月11日

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ゲノム合成の技術進展招待有り

末次正幸

第96回日本細菌学会総会（シンポジウム） 2023年3月17日

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OriCiro technology from academia research 招待有り

末次正幸

理研IMS 社会実装セミナー 2023年2月24日

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染色体複製サイクル再構成系とゲノム合成招待有り

末次正幸

大阪公立大セミナー 2023年1月12日

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In vitro統合再構成で紐解く細菌ゲノムの自己複製原理招待有り

末次正幸

第45回日本分子生物学会年会（ワークショップ） 2022年12月1日

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様々な産業に変革をもたらしていく最先端の合成生物学の潮流招待有り

末次正幸

ケミカルマテリアルJapan2022 2022年10月23日

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In vitro 再構成で明らかになってきた複製・転写・翻訳の協調的進行招待有り

末次正幸

日本遺伝学会第９４回大会（ワークショップ原核生物の細胞増殖研究から見えてくる遺伝学の新たな課題） 2022年9月14日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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メガサイズ染色体のバクテリア細胞への出し入れおよび増幅の技術招待有り

末次正幸

第44回日本分子生物学会年会ワークショップ「細胞核を造る」 2021年12月3日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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なぜ今、合成生物学なのか招待有り

末次正幸

日本科学哲学会第54回大会特別講演 2021年11月27日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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大腸菌のメガサイズゲノムの合成と移植の技術招待有り

末次正幸

第73回日本生物工学会大会シンポジウム 2021年10月27日

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会議種別：口頭発表（招待・特別）

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人工ゲノムのセルフリー合成招待有り

末次正幸

バイオインダストリー協会発酵と代謝研究会第１回勉強会「ゲノム合成」の秘めた可能性について 2021年7月21日

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会議種別：公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等

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メガスケールのDNA合成技術とその応用招待有り

末次正幸

第2回東京理科大学総合研究院合成生物学研究部門シンポジウム 2021年2月19日

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In vitro amplification of mega-sized circular DNA and its applications 招待有り

Masayuki Su'etsugu

I2BCParisSaclay virtual seminar 2021年1月22日

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DNA連結・増幅反応を用いたコンビナトリアル遺伝子ライブラリー作成招待有り

末次正幸

遺伝研研究会「微生物における大規模ゲノム・代謝改変技術とその利用」、遺伝研 2019年11月

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Cell-free assembly and amplification technology for genome-scale large DNA

Su'etsugu, M

The 2nd Asian Synthetic Biology Association, Chengdu, China 2019年10月

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Cell-free DNA technology for synthetic biology

Su'etsugu, M

SynbioBeta 2019, San Francisco, USA 2019年10月

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大腸菌ゲノム複製サイクル再構成系とその自己複製招待有り

末次正幸, 長谷部友憲, 高田啓

日本遺伝学会第91回大会、福島 2019年9月

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Cell-free assembly and amplification of genome-scale DNA

Su'etsugu, M

Marine Biotechnology Conference, Shimizu, Japan 2019年9月

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Cell-free assembly and amplification of genome-scale DNA

Su'etsugu, M

2019 Synthetic Biology: Engineering, Evolution & Design (SEED), New York, USA 2019年6月

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ゲノム合成時代のセルフリー技術招待有り

末次正幸, 奈良聖亜, 倉田竜明

日本農芸化学会 2019大会シンポジウム「ゲノム合成の世界的なうねりと現状：日本の貢献」、東京農業大学 2019年3月

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染色体複製サイクルを再構成した高性能DNA増幅技術とその利用

末次正幸

野地ImPACT公開シンポジウム、東京大学 2019年3月

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ゲノム合成の新技術

末次正幸

Nano tech 2019、東京ビックサイト 2019年1月

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In vitro repetition of chromosome-replication cycle and its applications 招待有り

Su'etsugu, M

7th Bioscience;Biotechnology International;Symposium, Tokyo;Institute of Technology 2019年1月

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長鎖DNA増幅反応RCRと共役した遺伝子編集法

俵木彩子, 末次正幸

第４１回日本分子生物学会年会 2018年11月30日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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Large plasmid synthesis using cell-free chromosome replication technology 招待有り国際会議

Su'etsugu, M, Kurata, T

The 1st Asian Synthetic Biology Association 2018年11月24日

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記述言語：英語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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Stable amplification of 200 kb circular DNA by reconstituted replication cycle of the Escherichia coli chromosome 国際会議

Shinohara T, Su’etsugu M

11th 3R+3C Symposium 2018年11月12日

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記述言語：英語会議種別：ポスター発表

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無細胞長鎖DNA合成法RA-RCRによる５０種以上のDNA断片の同時集積

倉田竜明, 末次正幸

「細胞を創る」研究会11.0 2018年10月18日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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oriCトランスポゾンを利用した環状DNA の試験管内複製サイクル増幅

奈良聖亜, 末次正幸

「細胞を創る」研究会11.0 2018年10月18日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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複製サイクル再構成系を利用した長鎖DNAへの塩基置換導入法

俵木彩子, 末次正幸

「細胞を創る」研究会11.0 2018年10月18日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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染色体複製サイクル再構成系を用いたセルフリー環状DNA合成招待有り

末次正幸

第56回日本生物物理学会年会シンポジウム「ゲノム合成時代の人工細胞研究」 2018年9月15日

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記述言語：英語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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50種類以上に及ぶDNA断片の試験管内同時集積

倉田竜明, 加納巧希, 末次正幸

第15回 21世紀大腸菌研究会 2018年5月24日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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oriCトランスポゾン転移に依存した長大な異種環状DNA の試験管内増幅

奈良聖亜, 篠原赳, 末次正幸

第15回 21世紀大腸菌研究会 2018年5月24日

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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放線菌で見つかった新規ミスマッチ修復タンパク質EndoMSのエンドヌクレアーゼ活性

沼田格, 竹本訓彦, 秋山徹, 末次正幸

第15回 21世紀大腸菌研究会 2018年5月24日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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複製停止配列ter を介したフォークの衝突は続く増幅反応を阻害する

長谷部友憲, 末次正幸

第15回 21世紀大腸菌研究会 2018年5月24日

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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In vitro amplification of circular DNA mediated by oriC transposon 国際会議

Nara, S, Su'etsugu, M

International Symposium on “Artificial Cell Reactor Science and Technology” 2018年4月6日

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記述言語：英語会議種別：ポスター発表

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Enzymatic construction of large circular DNA from over 50 overlapping fragments 国際会議

Kurata, T, Su'etsugu, M

International Symposium on “Artificial Cell Reactor Science and Technology” 2018年4月6日

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記述言語：英語会議種別：ポスター発表

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Cell-free tool towards de novo genome synthesis 招待有り国際会議

Su'etsugu, M

International Symposium on “Artificial Cell Reactor Science and Technology” 2018年4月6日

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記述言語：英語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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ゲノム複製サイクル再構成による巨大環状DNA の試験管内増幅招待有り

末次正幸

シンポジウム「核酸の科学：その複製，化学修飾から損傷まで」 2018年2月

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記述言語：英語会議種別：口頭発表（一般）

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PCRを凌駕！細胞を使わない次世代ゲノム合成技術招待有り

末次正幸

第30回つくばライフサイエンス推進協議会ピッチ会 2018年1月

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記述言語：日本語会議種別：公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等

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細胞を使わない次世代ゲノム合成ツール招待有り

末次正幸

JST新技術説明会 2018年1月

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記述言語：日本語会議種別：公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等

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ゲノム複製サイクル再構成系を利用した新規DNA増幅技術招待有り

末次正幸, 加納巧希, 倉田竜明, 篠原赳, 高田啓

ConBio2017 2017年12月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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人工ゲノム合成に向けた無細胞技術招待有り

末次正幸

第4回野村集団微生物制御プロジェクトERATOイノベーションセミナー 2017年11月

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記述言語：日本語会議種別：公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等

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DNA集積・増幅反応からなる無細胞ゲノム合成技術招待有り

末次正幸, 倉田竜明

「細胞を創る」研究会10.0「ゲノム合成時代の到来とバイオセキュリティ・セーフティ」 2017年10月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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染色体複製サイクルの繰り返しによる環状DNAの試験管内自律増殖招待有り

末次正幸, 高田啓

第55回日本生物物理学会年会 2017年9月

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記述言語：英語会議種別：口頭発表（一般）

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Cell-free propagation of large circular DNA by reconstitution of a chromosome replication-cycle 国際会議

Su'etsugu, M, Tsujimoto, H

Gordon Research Conference "Synthetic Biology" 2017年8月

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記述言語：英語会議種別：ポスター発表

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複製サイクル再構成系における転写・翻訳の共役と分子進化の試み

高田啓, 末次正幸

第14回 21世紀大腸菌研究会 2017年6月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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ゲノム複製サイクル再構成による長鎖環状DNAの試験管内増幅技術招待有り

末次正幸

酵素工学研究会第７７回講演会 2017年4月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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10万塩基を超える長鎖環状DNAの無細胞クローニング招待有り

末次正幸, 平田稜, 倉田竜明, 篠原赳, 辻本寛子

第１１回ゲノム微生物学会年会シンポジウム「微生物での合成生物工学」 2017年3月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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大腸菌染色体複製サイクルと転写翻訳反応との統合再構成招待有り

末次正幸, 辻本寛子, 高田啓

第89回日本生化学会大会シンポジウム「生化学の基盤戦略：試験管内再構成」 2016年9月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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ゲノム複製サイクル試験管内再構成系における変異誘発と分子進化招待有り

末次正幸, 徳永翼, 高田啓, 辻本寛子

日本進化学会第18回大会ワークショップ「再構築型進化学研究－人工細胞から原始生物まで－」 2016年8月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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ゲノム複製の試験管内再構成系とその合成生物学的展開招待有り

末次正幸

第13回原子・分子・光科学（AMO）討論会 2016年6月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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複製サイクル再構成によるミニ染色体の指数増殖招待有り

末次正幸

生命動態システム科学四拠点合同シンポジウム「生命動態の分子メカニズムと数理」 2016年3月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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大腸菌染色体複製サイクルの試験管内再構成招待有り国際会議

末次正幸

第89回日本細菌学会総会ワークショップ「バクテリア細胞増殖プロセス研究の最前線」 2016年3月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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複製開始・終結・分離サイクルの統合再構成系における環状染色体のふるまい

末次正幸, 辻本寛子

第23回DNA複製・組換え修復ワークショップ 2015年10月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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大腸菌における細胞周期依存の転写活性変動のリアルタイム観測系を用いた解析

松本健佑, 末次正幸

第３７回分子生物学会年会 2014年12月

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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大腸菌遺伝子転写の細胞周期制御招待有り

末次正幸, 松本健佑, 小林寛子

「細胞を創る」研究会7.0 2014年11月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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バクテリア染色体複製のリズム招待有り

末次正幸

生物リズム若手研究者の集い 2013年8月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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試験管内再構成系における大腸菌ミニ染色体複製の開始—伸長—終結サイクル

末次正幸, 片山勉

第85回日本生化学会大会 2012年12月

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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試験管内再構成系における大腸菌ミニ染色体複製の開始?伸長?終結サイクル

末次正幸, 片山勉

第85回日本生化学会大会 2012年12月

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記述言語：日本語会議種別：ポスター発表

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大腸菌ミニ染色体複製の試験管内再構成における粗画分系と精製系の解析

末次正幸, 片山勉

日本遺伝学会第84回大会 2012年9月

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記述言語：日本語会議種別：シンポジウム・ワークショップパネル（公募）

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枯草菌染色体複製とその開始制御におけるDnaNクランプの役割

末次正幸, Errington, J

第24回微生物シンポジウム 2012年9月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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枯草菌DnaNクランプの染色体複製開始制御における役割

末次正幸, Errington, J

2012年度グラム陽性菌ゲノム機能会議 2012年8月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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バクテリアゲノム複製蛋白質クランプのin vivo生化学

末次正幸, Errington, J

第６回日本ゲノム微生物学会年会 2012年3月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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Dynamic behavior of the replicase sliding clamp in Bacillus subtilis

Su’etsugu, M, Errington, J

第34回日本分子生物学会年会 2011年12月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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枯草菌染色体の再複製開始制御におけるクランプの役割

末次正幸, Errington, J

第21回DNA複製・組換え・ゲノム安定性制御ワークショップ 2011年10月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（一般）

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枯草菌スライディングクランプの細胞内動態

末次正幸, Errington, J

第8回21世紀大腸菌研究会 2011年5月

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記述言語：日本語会議種別：口頭発表（招待・特別）

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Subcellular and chromosomal distribution of the DnaN clamp of Bacillus subtilis during the replication cycle 国際会議

Su’etsugu, M, Errington, J

EMBO Conference on Replication/repair and segregation of chromosome 2010年5月

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記述言語：英語会議種別：ポスター発表

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所属学協会

日本分子生物学会

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共同研究・競争的資金等の研究

大腸菌ゲノム自己複製動態のin vitro再構成

日本学術振興会科学研究費助成事業

末次正幸

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2024年4月 - 2028年3月

課題番号：24K02007

配分額：18720000円（直接経費：14400000円、間接経費：4320000円）

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超並列たんぱくプリンタシステムの開発

科学技術振興機構JST 革新的GX技術創出事業(GteX)

野地博行, 末次正幸, 新井宗仁, 太田禎生

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2023年10月 - 2028年3月

担当区分：研究分担者

古典的な酵素探索では、候補遺伝子をクローニングし大腸菌などを用いて発現・精製・評価を行う。しかしながら、細胞培養・精製などの手間に加え、コスト及び作業の複雑さから103-4を超える種類の酵素を一度に合成・評価することは現実的に不可能である。酵素探索・開発のボトルネックを解消するために、以前我々が開発した無細胞技術による酵素スクリーニング技術を刷新する。使いやすく安価な目的遺伝子回収技術と計測モダリティ拡張により蛍光基質以外にも対応できる酵素活性評価技術を備えた汎用型の超並列高活性酵素スクリーニング技術へと進化させる。並行してDNAバーコード技術と無細胞DNA連結・増幅技術を融合させ、比較的安価なオリゴプールから複数の酵素遺伝子を無細胞合成する技術を開発する。それらを統合し、超高速に多種類の酵素を合成し性能評価するプロトタイピング技術、すなわち「たんぱくプリンタ」を開発する。GX酵素のプロトタイピングを行い、カーボンニュートラルに資する優れた性能をもつ酵素を開発する。

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免疫系ヒト化動物を活用した抗感染症ヒト抗体創成基盤の確立

AMED AMED-CREST

冨塚一磨, 香月康宏, 秋田英万, 末次正幸

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2021年10月 - 2027年3月

担当区分：研究分担者

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ゲノム安定性維持のために染色体にプログラムされた複製阻害領域の分子機構とその役割

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C)

秋山昌広, 末次正幸, 日詰光治, 大島拓

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2021年4月 - 2024年3月

課題番号：21K06120

配分額：4160000円（直接経費：3200000円、間接経費：960000円）

チミン飢餓はDNA複製を阻害し、真核生物でも微生物でも、細胞が生存力を消失する「チミン飢餓死」を生じる。医療現場で使われている抗がん剤5-FUや抗菌剤ST合剤は、チミン合成を阻害してこのチミン飢餓死を誘導する。しかし、染色体上の複製フォークの動態は、微生物でも真核生物でもゲノムワイドなレベルで明らかでないため、チミン飢餓死の機構は、その発見から60年以上たっても謎のままである。それは、チミン合成の阻害によってチミン飢餓死を誘導する抗がん剤や抗菌剤の改善や発展を妨げている。
研究代表者は、チミジン不足状態の大腸菌の複製フォークが、複製開始点oriCの両側近傍に位置する約200kbのゲノム領域（複製遅延領域FTZ: Fork Trapping Zone）で進行阻害されること、および、そのFTZ領域はチミン飢餓死で消失するゲノムDNA領域と一致することを見出した。ところが、現在のDNA複製の概念では、ヌクレオチド欠乏による複製フォークの進行阻害はゲノムのどの位置でもランダムに起きて、それがゲノムの不安定化に繋がるはずである。このFTZに選択的な複製阻害とゲノム不安定化は、単純なチミン不足による複製阻害だけで説明できない。
本研究では、(1) FTZを持つ人工染色体のセルフリー複製系での解析や、（2）FTZ領域をゲノムから欠失させた大腸菌の解析によって、「ヌクレオチド不足時に、FTZで複製フォークの進行を阻害する仕組みと、その役割は何か」というオリジナルな問いに対する答えを明らかにする。それによって、現在のDNA複製の概念では説明できないチミン飢餓での複製阻害とゲノム不安定化のメカニズムの解明を目指す。
2021年度は、FTZのコア領域50kbを含む人工染色体を構築できた。さらに、大腸菌の複製タンパク質を用いて、この人工染色体を試験管内でセルフリー複製することができた。

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人工ゲノムのセルフリーOn chip合成とその起動

文部科学省 JST CREST 「ゲノム合成」

末次正幸

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2018年10月 - 2024年3月

資金種別：競争的資金

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薬剤耐性菌を殺菌する広宿主域バイオロジクスの開発

AMED 新興・再興感染症研究基盤創生事業（多分野融合研究領域）

氣駕恒太朗, 鈴木仁人, 新谷政己, 末次正幸

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2020年12月 - 2023年3月

担当区分：研究分担者

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染色体複製サイクル再構成系の高度化で探るゲノム機能

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)

末次正幸

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2020年4月 - 2023年3月

課題番号：20H03238

配分額：17680000円（直接経費：13600000円、間接経費：4080000円）

大腸菌染色体複製のサイクルを再構成した複製サイクル再構成系では、ゲノムサイズの環状DNA分子の指数的な増幅が達成される。大腸菌をモデルとした研究では、複製系以外にも転写・翻訳、DNA修復、組換え、複製周期制御など、ゲノムにまつわる多くのシステムが試験管内再構成されている。本研究ではこれらシステムを複製サイクル再構成系に融合し、ゲノム動態の統合的な再現を目指す。システムだけでなくゲノム（染色体）自体を試験管内に取り出しての再現も進める。試験管内に高度に再現されたゲノム動態に対し、従来細胞を対象に用いられてきたオミックス的解析手法を適用し、新しいアプローチでゲノム機能に迫る。
初年度となる当該年度では、染色体複製サイクル再構成系に転写再構成系を融合し、同じミニ染色体上で、複製反応、転写反応が相互に及ぼす影響について解析を進めた。従来までにT7ファージのRNAポリメラーゼを用いた転写反応を組み合わせていたが、実際の細胞内の反応を再現すべく大腸菌RNAポリメラーゼを用いた転写反応との融合を行った。この複製・転写融合系において、複製と転写が効率よく共役して進行する条件を検討し、その共役に必要ないくつかの因子を同定した。そして、これらの因子の効果についてリアルタイムPCRをもちいた定量的なデータも得た。
さらに、染色体自体を試験管内に取り出して生化学的解析に用いる実験に対しては、染色体を大腸菌からスーパーコイルDNAとして壊さずに精製する技術を構築した。通常の大腸菌ゲノムは4.6Mbサイズで壊さずに精製することが難しいが、我々は染色体を分断する技術を独自に開発し、得られた1Mb分断染色体であればスーパーコイルDNAとして精製可能であることを見出した。

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先端的順逆遺伝学手法を用いたSARS-CoV-2の伝播機構解明

国立研究開発法人日本医療研究開発機構新興・再興感染症研究基盤創生事業

末次正幸

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2020年9月 - 2022年3月

担当区分：研究分担者

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原核生物で見出された非従来型（mutS 非依存型）DNAミスマッチ修復機構の解析

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C)

竹本訓彦, 末次正幸

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2018年4月 - 2021年3月

課題番号：18K06190

資金種別：競争的資金

配分額：4290000円（直接経費：3300000円、間接経費：990000円）

従来型ミスマッチ修復機構ではinsertionやdeletionを含む様々な種類のミスマッチを認識し、修復する事ができる。一方で我々はC. glutamicumのEndoMSがG/T,G/G,T/Tミスマッチのみを特異的に切断することを明らかにしていた。2017-2018年度にかけてC. glutamicumにおいて全ゲノムレベルでの変異を検出するMutation Accumulation Assayを行い、EndoMSの基質特異性がendoMS遺伝子破壊株で発生率が上昇する変異の種類とうまく合致することを示す結果を得た。これらの結果から、EndoMSは短いinsertionやdeletionのによるミスマッチを認識できないにもかかわらず、C. glutamicumでは短いinsertionやdeletionの発生率が従来型システムをもつ生物と大きく変わらないことが明らかとなった。これらの結果をまとめた論文をNucleic Acid Research誌に発表した。
細胞内で複製エラー・EndoMS依存的に二本鎖切断が行われているかを確認するため、EndoMSの発現をIPTG添加の有無により制御できるシステムを開発し、染色体上のendoMS遺伝子の位置と置き換えた株を作製した。同株ではIPTG添加の有無によりEndoMSの発現量を制御でき、変異率が変化することを確認している。
遺伝子のアノテーション情報をもとにEndoMSが切断した後に機能することが予想される18個の遺伝子の破壊株を作製し、変異率への影響を確認した。いずれの遺伝子破壊株でも変異率上昇は確認できなかった。

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In vitro再構成されたゲノム自己複製システムのふるまいとその進化

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)

末次正幸, 高田啓

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2016年7月 - 2020年3月

課題番号：16KT0076

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：18720000円（直接経費：14400000円、間接経費：4320000円）

複製の鋳型となるDNA分子（ミニ染色体）に自身の複製に必要な複製タンパク質群の情報を遺伝子のかたちでコードしておく。転写翻訳反応によってその情報を引き出せば、産生する複製装置によってDNA分子の新たなコピーが作られる。そのコピーはまた、転写翻訳によって次なる世代の複製装置を生み出すので、情報分子の継続的な自己複製のサイクルが繰り返されることとなる。
複製・転写・翻訳のそれぞれの反応系は、各反応ステップにおいて精製タンパク質をもちいた試験管内再構成系が構築されている。染色体複製システムとしては、20種をこえるペプチドを混ぜ合わせることによって、複製開始、終結、分離からなるミニ染色体の「複製サイクル」を何度も繰り返すような系も再構成できている。そこで、鋳型となるミニ染色体上に複製サイクル再構成系のタンパク質を遺伝情報の形でコードさせておき、その情報発現によって複製サイクルの進行を導くことができるような系の構築を進めた。遺伝情報発現においては転写翻訳反応再構成系であるPUREsystemを利用した。平成29年度までの検討の結果、ミニ染色体にコードされた複製開始遺伝子の転写翻訳に依存して、ミニ染色体自身の複製サイクルの開始を誘導できるような再構成系（ミニ染色体自己複製系）を構築し、このミニ染色体自己複製系を油中水滴エマルション内で反応させるための条件を決定した。平成30年度は、複製開始遺伝子だけでなく、「複製サイクル」に必要な20種以上の因子についてもPUREsystemから発現した遺伝子による複製反応の検討を行った。この検討により全構成因子を遺伝情報へと置換えるための条件が決まりつつある。
今後、これを基盤に、自己複製されるミニ染色体系を進化させるシステムの構築を進めていく予定である。

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人工ゲノムの試験管内合成法の開発

その他省庁等内閣府ImPACT 野地プログラム「人工細胞リアクタ」

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2016年4月 - 2019年3月

資金種別：競争的資金

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大腸菌染色体複製サイクル再構成による長大DNA増幅システムの開発

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的萌芽研究

末次正幸

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2014年4月 - 2017年3月

課題番号：26640116

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：3900000円（直接経費：3000000円、間接経費：900000円）

合成生物学の進展に伴って長鎖DNA増幅技術に対する期待が高まってきている。本研究では、独自に構築した「複製サイクル再構成系」を用いて長鎖環状DNAを増幅できるか検討した。「複製サイクル再構成」は大腸菌染色体複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの複製サイクルの反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。種々の条件検討の結果、200kb環状DNAを30℃、３時間の等温反応にて、効率よく増幅する条件を決定した。今後、バクテリアゲノムレベルの長鎖環状DNAを増幅可能かも検討し、「ゲノム丸ごと増幅技術」としての利用を世の中に広めて行きたい。

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染色体複製系の周期的駆動にむけた回路の再構成

文部科学省 JST さきがけ「細胞構成」

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2011年12月 - 2015年3月

資金種別：競争的資金

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枯草菌細胞内への細胞周期回路の人工合成

日本学術振興会科学研究費助成事業新学術領域研究(研究領域提案型)

末次正幸

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2012年4月 - 2014年3月

課題番号：24119513

配分額：14040000円（直接経費：10800000円、間接経費：3240000円）

大腸菌染色体複製開始蛋白質DnaAは、活性型と不活性型の割合が細胞周期を通じて変動する。このDnaA活性オシレーションは複製開始のタイミングを保証するだけでなく、遺伝子転写制御にも機能している。本研究では、枯草菌という異種細胞内への合成的なアプローチによって、大腸菌DnaA活性の周期動態を再現し、その作動原理を理解することを目指して検討を行った。DnaA活性オシレーションにおいては、複製装置因子クランプのDNA上への装着・解離の動態が重要である。複製とともにDNA上には多数のクランプ分子が蓄積する。このDNA装着型クランプに依存してDnaAの不活性化反応が導かれる。複製終結後、クランプがDNAから解離すると、この不活性化は解除される。我々はまず、大腸菌クランプのDNA上への装着・解離の動態を枯草菌細胞内において再現することができるか蛍光顕微鏡を用い、検討した。枯草菌内に発現させた大腸菌クランプについて、低効率ながらもうまくその染色体DNA上への装着を導く事が可能であった。このDNA装着は枯草菌の染色体複製周期に依存しており、複製終結後にクランプがDNAから解離して、細胞全体に拡散する様子も捉えることに成功した。続いて大腸菌DnaAについても枯草菌への導入を検討した。これは細胞増殖阻害を導くものであったが、うまく発現量を抑える事で、その導入が可能であった。また、導入されたDnaAについて枯草菌核様体上への局在化が見られた。次に我々は、細胞内におけるDnaAの活性レベルを検出する系の開発を進めた。DnaAの転写制御活性を利用すれば、その活性変動を蛍光によりリアルタイム検出できると考え、独自のDnaA ChIP-seq解析の結果も踏まえ、検出系を構築した。そして、大腸菌をもちいた検討により、この系が細胞内DnaAの活性変動を検出する上で有用である事を示す事ができた。

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バクテリア複製蛋白質の細胞内ダイナミクス

民間財団等上原記念生命科学財団海外留学リサーチフェローシップ

末次正幸

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2010年4月 - 2011年3月

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

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バクテリアにおける複製ファクトリー形成の分子機構の解明

文部科学省日本学術振興会海外特別研究員

末次正幸

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2008年4月 - 2010年3月

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

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ＤｎａＡ複製開始活性を複製周期と共役して抑制する因子Ｈｄａの機能制御メカニズム

日本学術振興会科学研究費助成事業

末次正幸

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2006年4月 - 2008年3月

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

ＤｎａＡ複製開始活性を複製周期と共役して抑制する因子Ｈｄａの機能制御メカニズムについて調べる

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開始のオン・オフにより周期的に複製を行う大腸菌ミニ染色体複製サイクルの再構成

文部科学省科学研究費助成事業

末次正幸

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2006年4月 - 2008年3月

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

開始のオン・オフにより周期的に複製を行う大腸菌ミニ染色体複製サイクルの再構成系の構築を行う

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細胞周期に依存した複製開始因子不活化システムの発動を制御する蛋白質間相互作用

日本学術振興会科学研究費助成事業若手研究(B)

末次正幸

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2008年 - 2008年

課題番号：20770138

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：3120000円（直接経費：2400000円、間接経費：720000円）

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開始のオン・オフにより周期的に複製を行う大腸菌ミニ染色体複製サイクルの再構成

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究

末次正幸, 片山勉

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2006年 - 2007年

課題番号：18048033

配分額：3300000円（直接経費：3300000円）

染色体複製の開始は細胞周期進行と連動して周期的に制御されている。大腸菌では、染色体複製起点を持つプラスミドDNAを鋳型とし、精製蛋白質を用いて染色体複製を再構成できる(ミニ染色体複製系)。複製開始反応は開始蛋白質DnaAのATP結合型(活性型)とADP結合型(不活性型)の変換によって制御されている。ATP-DnaAはRIDAという複製伸長反応と共役したDnaA結合性ATP加水分解機構によってADP-DnaAに変換される(不活性化システム)。またin vitroにおいては、特異的なDNA配列DARSによって、DnaA結合性ADPが解離し、ATP再結合が促されることが見いだされている(再活性化システム)。本研究では、開始のオン・オフによりコントロールされた複製サイクル系の再構成を目指すべく、不活性化システムの試験管内再構成系を確立した。この再構成系にはクランプと呼ばれるDNAポリメラーゼIII複合体のサブユニットとHdaタンパク質が必要である。不活性化システム再構成系を用いた解析から、ヌクレオチド結合によって促されるHdaの多量体構造の変換が、不活性化システムの発動に必要であることを見いだした。このHdaヌクレオチド結合は細胞内においてもDnaA活性制御に重要であった。さらに我々は、DARSが細胞内において再活性化に重要な機能を果たしていることを示し、DARS活性を調節する新規活性を見いだした。これらの結果は複製開始のオン・オフを制御する分子メカニズムを示唆するものであり、その周期性を再構成する上で重要な知見を提供するものである。

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DnaA複製開始活性を複製周期と共役して抑制する因子Hdaの機能制御メカニズム

日本学術振興会科学研究費助成事業若手研究(B)

末次正幸

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2006年 - 2007年

課題番号：18770155

配分額：3700000円（直接経費：3700000円）

染色体の複製開始反応は細胞周期中ただ1回のみ起こるよう厳密に制御されている。大腸菌DnaAはATP結合型で複製開始を引き起こす。DnaAに結合したATPは、DnaA不活性化因子HdaとDNA装着型クランプ(DNAポリメラーゼIIIβサブユニット)とに依存して加水分解され、不活性なADP結合型DnaAが産生する。このDnaA制御システムはRIDAと呼ばれ、重複複製を抑制するために必須である。本研究ではまず、hda翻訳がこれまで推測されていた開始コドン(GUG)よりも15コドン下流に位置するCUGから開始していることを見いだした。大腸菌において翻訳効率が著しく低いCUGを開始コドンとして利用している遺伝子はこれが初めてであり、Hdaの細胞内量が氏いことと関連していると思われる。同定した開始コドンより翻訳したHdaは高活性体として精製された。さらにdaは、ADP特異的に結合能を示し、ATPや他のヌクレオチドとは結合しないというユニークな性質を持っていた。ADP結合型Hdaは単量体として存在し、RIDA再構成系においてDnaA結合ATPの加水分解活性を示した。一方、DP非結合型HdaはRIDAに不活性なホモ多量体を形成した。DNA装着型クランプとの結合能はADP結合型、非結合型Hdaに関わらず見られたものの、続くDnaAとの相互作用にはADP結合型Hdaが必要であった。おそらく、DP結合によるHdaの活性化には、モノマー化によるDnaA相互作用部位の露出が関与していると考えられる。さらに我々は細胞内においてもHdaがADP結合型として存在していること、またADP結合がHdaの細胞内機能に重であることを見いだした。以上の結果はHdaがADP結合1解離を通してDnaA不活性化システムの発動を制御するスイッチとして働く可能性を提唱するものである。

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染色体複製開始とその制御を行う、動的かつ複合的蛋白質高次装置の機能構造特性

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)

片山勉, 植田正, 麻生真理子, 末次正幸, 胡桃坂仁志

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2004年 - 2006年

課題番号：16370081

配分額：13500000円（直接経費：13500000円）

DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行するほか、複製開始制御機構の標的因子ともなっている。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、「DnaAが直接関わる、動的かっ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指した。
1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明
まず、超好熱菌DnaA蛋白質を精製して、機能解析した。大腸菌以外では初めてとなるin vitro複製開始再構成系を構築することに成功した。さらにこのDnaAを用い複製開始複合体の結晶作成を進めた。また、大腸菌DnaAのN末ドメインの機能構造解析を進め、DnaA-DnaA相互作用機構とDnaBヘリカーゼ装着機構を解明した。また、DnaAのATP複合体形成動態解析を進め、新たな機能構造を解明した。
2.DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関
Hda機能解析を進め、Hdaの複合体形成との機能構想相関を見いだした。クランプの機能構造解析を進め、Hdaとの相互作用機構を検討した。さらに、新規のクランプ結合因子の機能解析を進めた。さらにDnaA相互作用因子の探索をプロテオミクス手法で行い、多種の因子を同定し、機能解析を進めた。
3.新規DnaA相互作用因子の機能構造解析:DnaA-DiaA複合体の機能解析
多種のDiaA変異体を分離し機能構造相関解析を進めた。DiaAの結晶構造解明に成功した。DnaA-DiaA複合体が複製開始複合体の形成促進を行うことを初めて解明した。
4.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発
DnaAドメインIVを結合標的とした化学修飾オリゴヌクレズチドを設計し、合成に成功した。これを用いて結合様式などの解析を進めた。

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DNA複製マシンによる複製開始フィードバック制御の分子機構

日本学術振興会科学研究費助成事業特別研究員奨励費

末次正幸

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2002年 - 2003年

課題番号：02J09038

配分額：1000000円（直接経費：1000000円）

当研究室では、大腸菌染色体の複製開始蛋白質DnaAに結合したATPの水解により、DnaAの不活化を導く機構、RIDA(Regulatory Inactivation of DnaA)を見出している。RIDAに8は、DNAポリメラーゼIIIβサブユニットがDNAにロードされ、βクランプを形成することが必要である。よって、複製装置にはフィードバック的に、複製開始を抑制するという概念が提唱される。最近、RIDAに必須な新奇蛋白質Hdaが同定され、RIDA構成因子が出揃った。そこで本研究では、Hisタグ融合型としてHdaを精製し、RIDA反応を生化学的に解析した。
まず、RIDA再構成系(DNAにロードされたβクランプをゲル濾過により単離し、これを用いてHdaに依存したDnaA結合性ATPの加水分解を行う)を構築し解析した結果、HdaはADP結合により活性型となることが示唆された。実際、フィルターバインディング法により、HdaはADPに高い特異性を持って結合することがわかった(Kd値、約2μM)。
次に、βクランプ・Hda・DnaAの3者の相互作用について検討した。まず、プルダウン法により、βサブユニットはHdaと直接結合することがわかった。さらに、ゲル濾過による解析から、DNAにロードさせたβサブユニット(βクランプ)はHdaおよびATP結合型DnaAにそれぞれ単独で結合することが見出された。よって、βクランプを足場にしてHdaとATP-DnaAが相互作用する可能性が示唆される。このときHdaがDnaA結合性ATPに作用し、その加水分解を促しているのかもしれない。DnaAおよびHdaはともにAAA+型ATPase蛋白質であるが、一部のAAA+蛋白質については、複合体を形成し、分子間の境界でATP加水分解を行うことが提唱されている。RIDAの分子機構もこれと矛盾しないと思われる。

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産業財産権

無細胞系でDNAを編集する方法

末次正幸, 俵木彩子, 加納巧希

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：JP2019029793 出願日：2019年7月30日

特許番号/登録番号：特許第7025552号登録日：2022年2月15日

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機能性DNAカセット及びプラスミド

末次正幸, 向井崇人

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：特願2022-006523 出願日：2022年1月19日

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環状DNAの複製または増幅方法

末次正幸, 奈良聖亜

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：特願2019-503056 出願日：2018年2月28日

特許番号/登録番号：特許第6960684号登録日：2021年10月14日

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環状DNAの製造方法

末次正幸, 奈良聖亜

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：特願2021-148639 出願日：2021年9月13日

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環状DNAの増幅方法

末次正幸, 辻本寛子, 篠原赳

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：特願2018-518326 出願日：2017年5月17日

特許番号/登録番号：特許第6764193号登録日：2020年9月15日

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DNAの産生方法及びDNA断片連結用キット

末次正幸, 倉田竜明

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：特願2019-527961 出願日：2018年7月5日

特許番号/登録番号：特許第6701450号登録日：2020年5月8日

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無細胞系でDNAを編集する方法

末次正幸, 俵木彩子, 加納巧希

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：JP2019029793 出願日：2019年7月30日

公表番号：WO2020-027110 公表日：2020年2月6日

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DNAの産生方法及びDNA断片連結用キット

末次正幸, 倉田竜明

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：JP2018025528 出願日：2018年7月5日

公表番号：WO2019-009361 公表日：2019年1月10日

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環状DNAの複製または増幅方法

末次正幸, 奈良聖亜

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出願人：オリシロジェノミクス株式会社

出願番号：JP2018007485 出願日：2018年2月28日

公表番号：WO2018-159669 公表日：2018年9月7日

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環状DNAの増幅方法

末次正幸, 小林寛子

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出願人：国立研究開発法人科学技術振興機構

出願番号：特願2016-560254 出願日：2015年11月18日

特許番号/登録番号：特許第6262877号登録日：2017年12月22日

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環状DNAの増幅方法

末次正幸, 辻本寛子, 篠原赳

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出願人：国立研究開発法人科学技術振興機構

出願番号：JP2017018472 出願日：2017年5月17日

公表番号：WO2017-199991 公表日：2017年11月23日

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社会貢献活動

サイエンスカフェ「合成生物学でワクワクれ！ZOKKONグランプリ」

出演

立教SCOLA 2023年9月20日

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種別：サイエンスカフェ

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JST RISTEX「ゲノム倫理」研究会ケーススタディ＿末次PJ

情報提供

JST 2023年

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メディア報道

iGEM-2023年パリ大会、初出場で世界一！インターネットメディア

コスモバイオ Lab.First 2024年3月

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合成生物学のロボコン、世界一を獲った高校生チーム新聞・雑誌

日経新聞 2024年1月

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DNAを増やす新技術テレビ・ラジオ番組

ＢＳテレ東居間からサイエンス 2023年11月

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試験管でDNA無限増殖進化プロセスの再現目指す新聞・雑誌

日経サイエンスフロントランナー挑む 2023年11月

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mRNAはもうできている？インターネットメディア

ZEROICHI（ホリエモン対談） 2023年5月

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モデルナが110億円で日本のバイオベンチャーを買収「試験管の中で生命を創る」“合成生物学”とはインターネットメディア

Abema Times https://times.abema.tv/articles/-/10081266 2023年5月

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あのモデルナが約110億円で買収した立教大発ベンチャーの実力新聞・雑誌

日経新聞 2023年2月

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僕は「生命をつくる」ためにこの技術を開発したインターネットメディア

NewsPicks 2023年1月

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